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酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)是一種常用的基于抗原和抗體之間特異性鍵的分析免疫化學(xué)測定。ELISA實驗優(yōu)化過程中應(yīng)測試許多因素,，例如用于包衣的抗原或抗體的濃度,、溫度,、各個步驟的持續(xù)時間,、包被緩沖液的類型，例如磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)或碳酸鹽緩沖液,、樣品制備方法,。那么我們該如何優(yōu)化ELISA實驗呢？讓我們一起來看看吧,！
1. 抗原涂層
?、?ELISA的第一步是用抗原包被孔或捕獲抗體。
?、?大多數(shù)情況下,，這包括將PBS或碳酸鹽緩沖液中的蛋白質(zhì)溶液應(yīng)用于微量滴板孔。用于包被蛋白質(zhì)的微量滴定板是具有改性表面的特殊板,，即對具有極性或親水基團的分子具有高親和力的高電荷聚苯乙烯表面,。
2. 飽和阻斷
① 用抗原涂覆ELISA板的過程依賴于孔固相的結(jié)合活性,，該固相將生物分子固定在孔表面,。之后的步驟是阻塞,。在封閉過程中，孔底部的游離結(jié)合位點被封閉緩沖液飽和,，以防止非特異性結(jié)合的可能性和孔的殘余結(jié)合能力,，從而大大提高信噪比和特異性。如果不進行適當(dāng)?shù)姆忾],，檢測抗體可能會與抗原非特異性結(jié)合,，導(dǎo)致高背景信號和低靈敏度。
?、?每個封閉緩沖區(qū)都代表了減少背景和保持特異性之間的折衷方案,。在某些情況下，全血清和血清蛋白白蛋白可引起非特異性ELISA信號,。
3. 樣品制備
稀釋劑的選擇很重要,。通常，標準稀釋劑應(yīng)盡可能與樣品的基質(zhì)相似,。
?、?例如，含BSA的PBS是ELISA中良好的血清替代品,，常用于生物學(xué)樣品,。下一個重要的稀釋劑成分是非離子去污劑(吐溫20、TritonX-100,、CHAPS),，在低濃度下，可防止非特異性(疏水性)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用,。特異性結(jié)合通常對洗滌劑更具抵抗力,。
② 如果分析物不是血清,，則可能需要選擇與PBS/Tween/BSA不同的稀釋劑,。在這種情況下，有必要檢查實驗樣品的標準曲線和稀釋線性,。其原因是標準稀釋劑或matix的成分對抗原/抗體相互作用的影響,。在這種情況下，應(yīng)進行加標回收或線性稀釋實驗,。
?、?加標回收：將一定量的標準品加入(加標)到樣品緩沖液或樣品中，并與未添加標準品的樣品同時測量,?？梢员容^添加到天然測試樣品基質(zhì)中的相同量的分析物和添加到標準稀釋劑中的相同加標值。
?、?在測試實驗樣品時,，重要的是測試幾種稀釋液,，全部一式兩份或一式三份，并結(jié)合已知標準品進行,，以確保最終結(jié)果落在標準曲線的線性部分內(nèi),。
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