抗體因其多種作用機制而成為天然的有效治療藥物。其中一種關鍵機制是受體介導的內化,。鑒于抗體與抗原結合的高度特異性,，與藥物、毒素或酶偶聯(lián)的抗體可以作為具有特異性的細胞毒性遞送劑,，在治療效果,，減少非靶向效應[1],。有效的治療性抗體偶聯(lián)藥物（ADC）不僅需要對腫瘤抗原具有特異性結合能力，還需要內化有效載荷（payload）以發(fā)揮細胞毒性效應,。ADC療法開發(fā)更為復雜,，涉及多個步驟，包括識別靶抗原,、發(fā)現(xiàn)理想抗體,、選擇細胞毒性有效載荷和連接子（linker），以及優(yōu)化偶聯(lián)化學——所有這些步驟從最初研究到治療應用可能需要數(shù)年時間[2,3],。在這個過程中,，一個顯著的瓶頸是缺乏早期階段的檢測方法來指導從數(shù)百個抗原結合克隆中篩選出功能性抗體[4]。

抗體內化可能很復雜且高度可變,，這取決于許多相互作用的因素,，包括抗體-靶標親和力、表位可及性,、細胞類型,、靶蛋白表達程度、蛋白質周轉等[5,6],。盡管流式細胞術,、共聚焦顯微鏡和高內涵成像等廣泛使用的方法對為研究抗體內化提供可靠方法，但它們在篩選大型抗體庫時受到復雜檢測操作,、通量有限和相對較高成本等限制,。鑒于這些挑戰(zhàn)，一個用于在早期發(fā)現(xiàn)階段識別抗體內化的高通量檢測將極大地加速ADC的開發(fā)[6],。

布魯克細胞分析（Bruker Cellular Analysis）提供了先進的抗體發(fā)現(xiàn)解決方案,，使客戶能夠在一周內篩選到有價值的單克隆抗體（圖1）。我們的方法注重初始階段的功能性篩選,，而不是產生一系列抗原結合hits后進行繁瑣,、昂貴且相對小規(guī)模的功能性分析。使用Beacon®單細胞功能表征平臺,，可以在一天內利用光電定位（OEP）技術分離數(shù)萬個單細胞,，再使用微珠和報告細胞檢測抗體分泌、抗原結合和受體特異性內化（圖1）,。

以雜交瘤細胞系為模型,，本應用說明展示了簡化早期發(fā)現(xiàn)階段內化抗體發(fā)現(xiàn)的新能力，超越了抗原特異性,，實現(xiàn)了高通量、實時評估功能性抗體,。我們的解決方案簡化了篩選過程,，使研究人員能夠在發(fā)現(xiàn)階段早期快速篩選,、識別并戰(zhàn)略性地導出具有最佳內吞特性的抗體。這種能力使得下游表征和優(yōu)化能夠集中在最有希望的候選抗體上,，最終加速理想抗體進入臨床應用的進程,。

圖1 | Opto® B Discovery工作流程能夠在一周內實現(xiàn)B細胞分離、激活,、自動化單細胞分離,、高通量功能篩選以及單克隆抗體序列回收。

受體特異性內化的模型系統(tǒng)開發(fā)

作為模型系統(tǒng),，本初步研究使用了兩種小鼠雜交瘤細胞,，OKT8（CRL-8014）和OKT3（CRL-8001），它們分別表達針對人CD8和CD3的單克隆抗體（圖2A）,。此外,，將JurkatCD3+/CD8-細胞作為陽性對照，RajiCD3-/CD8-細胞作為陰性對照,，以證明受體特異性內化（圖2B）,。在芯片上的檢測之前，我們通過芯片外的內化檢測首先驗證這些表達譜,，其中報告細胞與等濃度的熒光標記的抗CD3或抗CD8抗體一起孵育,。在與抗CD3抗體一起孵育的Jurkat細胞中觀察到了抗體內化，但與抗CD8抗體一起孵育時則沒有觀察到（圖2C）,。相比之下,，兩種抗體在Raji細胞系中均未顯示出內化（圖2D）。

圖2 | A) 利用雜交瘤OKT3和OKT8細胞系作為模型系統(tǒng)進行抗體內化實驗開發(fā),，這兩種細胞系分別表達單克隆抗CD3（藍色）和抗CD8（灰色）抗體,。B) JurkatCD3+/CD8-和RajiCD3-/CD8-細胞系被用作陽性與陰性對照，以展示受體特異性內化,。C) JurkatCD3+/CD8-細胞系與D) RajiCD3-/CD8-細胞系在96孔板中與熒光標記的抗CD3或抗CD8共孵育后,，所拍攝的20X倍率的落射熒光圖像。

芯片上用于篩選內化抗體

的Assay設計

將抗體分泌的OKT3和OKT8細胞系的細胞懸浮液依次導入Beacon®系統(tǒng)上的OptoSelect®芯片的通道中,。利用光電定位（OEP）技術在NanoPen®小室內進行單細胞分離后,，細胞被培養(yǎng)并利用基于微珠和細胞的檢測方法篩選抗體分泌和受體特異性內化。我們首先利用包被有小鼠特異性抗IgG抗體的檢測微珠篩選抗體分泌,，這些微珠懸浮在含有熒光標記二抗的培養(yǎng)基中（圖3A）,。將含有檢測珠子的培養(yǎng)基導入OptoSelect®芯片的通道中，微珠直接在分泌細胞上方捕獲抗體,，導致二抗的熒光聚集（圖3B和C）,。

圖 3 | A）用于檢測抗體分泌的基于珠子的捕獲檢測試劑結合了anti-IgG偶聯(lián)珠子和熒光團標記的二抗。B）將檢測試劑導入到OptoSelect®通道中，C）通過延時成像來觀察IgG分泌（綠色）,。

為了快速篩選內化抗體,，我們選擇了一種快速且易于使用的pH敏感標記試劑。Invitrogen™ Zenon™ pHrodo™ Deep Red IgG Labeling Reagent（Z25622）是一種與pH敏感熒光團結合的Fc特異性多克隆Fab片段,。在中性pH下幾乎不觀察到熒光,，只有當它位于酸性的晚期內體或者溶酶體腔室時，熒光團才會變得明亮（圖4A）,。這種在細胞外的微弱熒光信號對于在Beacon®上進行快速,、無需洗滌的檢測非常有利。對于芯片上的檢測,，將表達感興趣靶抗原的報告細胞懸浮在含有pH敏感內化試劑的培養(yǎng)基中,，并導入OptoSelect®芯片（圖4B）。從分離的細胞中分泌的抗體被內化試劑識別,；然而,，只有當抗體與報告細胞上的靶受體結合并內化時，熒光才會增強（圖4C,，Pen A）,。不與靶受體結合的非特異性抗體不會被內化，將導致檢測結果為陰性（圖4C,，Pen B）,。

圖4 | A）對于基于細胞的抗體內化檢測，表達目標受體的報告細胞系被懸浮在含有內化試劑的培養(yǎng)基中,。該內化試劑是一種與pH敏感熒光團偶聯(lián)的抗IgG Fc特異性Fab片段,，在堿性pH下熒光較弱，但在酸性條件下會變得明亮熒光,。當分泌的抗體-Fab復合物通過受體介導的內吞作用進入細胞時,，隨著其被運輸?shù)剿嵝詢润w/溶酶體腔室，熒光會急劇增加,。B）細胞和pH敏感的Fab試劑被導入到OptoSelect®通道中,，C）通過延時成像來觀察熒光的變化，從而指示抗體內化,。圖中（C）部分的彩虹“雷達”線有助于說明熒光擴散隨時間的擴展,。Pen A和Pen B來自圖3中展示的同一實驗。

芯片上的受體特異性抗體內化

鑒于本研究中模型細胞系的高抗體分泌率,，我們在OptoSelect® 3500芯片的每四個NanoPen®小室中僅加載一個OKT3或OKT8細胞,，以確保清晰的檢測讀數(shù)；得到的模式是在每種細胞類型之間留出一個空的小室（圖5A）,。為了方便起見,，我們在芯片上對細胞進行過夜培養(yǎng),，并在第二天進行檢測；也可以在同一天加載和檢測細胞,。利用之前描述的基于微珠的檢測評估抗體分泌,，識別兩種雜交瘤細胞系陽性IgG “blooming”（圖 5A）。

在IgG分泌檢測之后,，我們立即使用芯片內的基于細胞的檢測來分析抗體內化。為了保持報告細胞的活性并避免培養(yǎng)基酸化,，JurkatCD3+/CD8-或RajiCD3-/CD8-細胞在導入前新鮮制備,。將細胞以最佳密度懸浮在含有內化試劑的培養(yǎng)基中，以填滿通道區(qū)域（圖5B和C）,。利用Cell Analysis Suite（CAS®）軟件中的Capture Assay操作,，每隔10分鐘獲取一次熒光圖像，持續(xù)1至2小時,。預期能夠與靶抗原結合并在內化進入報告細胞的分泌抗體（分泌anti-CD3的OKT3雜交瘤細胞）會在NanoPen®小室上方產生增強的熒光（圖5B）,。不被報告細胞識別或者能夠結合但不內化的抗體，將不被判斷為陽性（圖5C）,。經過Image Analyzer軟件的分析,，98.4%分泌抗CD3的OKT3雜交瘤細胞在JurkatCD3+/CD8-報告細胞中顯示出陽性內化信號（圖 5D）。僅有1個NanoPen小室（0.74%）包含分泌抗CD8的OKT8細胞被標記為陽性（圖5D）,。經過進一步評估,，這個小室很可能是由于報告細胞漂移導致的假陽性。作為陰性對照,，使用不表達CD3或CD8的RajiCD3-/CD8-報告細胞重復內化檢測,，對于兩種雜交瘤都沒有得到內化陽性結果（圖5C和D）。

圖 5 | 三個連續(xù)檢測的代表性圖像,。A）來自分泌細胞（白色字體標示的Pen內）的IgG抗體被通道內的珠子捕獲,，導致熒光信號（綠色）增強。使用與pH敏感的pHrodo染料偶聯(lián)的抗小鼠Fc特異性Fab片段來檢測受體特異性內化,，B）使用JurkatCD3+/CD8- 細胞,，C）使用RajiCD3-/CD8-細胞。當抗體-Fab復合物被內化并隔離到酸性內體/溶酶體腔室時,，可觀察到內化試劑的熒光（品紅色,，pHrodo）（B中的 OKT3 細胞）。D）在 Jurkat 和 Raji 細胞中對抗體內化呈陽性的IgG陽性雜交瘤細胞的定量,。

報告細胞系選擇

盡管本文未深入討論,，但選擇合適的報告細胞系對于開發(fā)和成功進行基于細胞的檢測至關重要。然而由于抗體發(fā)現(xiàn)要求的多樣性和報告細胞系表達抗原的差異性,，不存在通用解決方案,。在執(zhí)行芯片檢測之前評估抗原表達水平和在整個細胞群體內的均勻表達至關重要,。抗原表達水平低將導致芯片上熒光“blooming”強度低而難以檢測,，表達水平高度不均勻則可能會導致假陰性結果,。此外，還需要考慮的因素包括細胞導入密度,、細胞健康狀況,、添加避免聚集的物質以及對于貼壁細胞系可能需要的解離步驟。

基于細胞的檢測注意事項和展望

本文描述的抗體內化檢測極大地擴展了Beacon®平臺的能力,，使其能夠快速,、高通量地評估抗體功能。盡管這項工作是高通量量化抗體內化的一個開創(chuàng)性的嘗試,，但當前工作流程存在一些局限性,。它允許對抗體內化進行二元識別；然而,，我們尚未證明是否可以用此方法對內化速率或效率進行排名,。此外，目前在未經過大量驗證和軟件優(yōu)化之前,，我們建議使用Image Analyzer軟件進行手動分析,。我們還注意到，鑒于需要長時間（>1小時）來觀察內化,，報告細胞在OptoSelect®芯片通道內的小流體漂移可能會改變看似檢測結果,，因此，我們發(fā)現(xiàn)手動查看時間序列圖像,，能夠更準確地識別檢測陽性,。本文描述的內化檢測展示了在開發(fā)早期識別有前景的抗體的能力上的重大進步。此外,，它為更全面的檢測和分析奠定了基礎,，包括評估內化的程度和速率等。在早期發(fā)現(xiàn)階段以的規(guī)模識別有利的抗體候選物將顯著推進ADC的開發(fā),。

結 論

Bruker Cellular Analysis提供的Opto® B Discovery工作流程解決方案能夠在一天內識別出數(shù)千個抗原特異性抗體hits,，不僅簡化了抗體發(fā)現(xiàn)過程，而且顯著快于傳統(tǒng)發(fā)現(xiàn)方法,。研究人員利用Beacon®系列單細胞光導系統(tǒng)不僅可以識別具有抗原特異性結合能力的抗體,，還能夠運行連續(xù)檢測來評估親和力、阻斷,、內吞特性等在內的抗體功能特性,。這種在發(fā)現(xiàn)階段早期識別具有所需靶標特異性屬性的候選物將極大地加速篩選過程，推進最佳候選抗體進入臨床試驗,。