關(guān)鍵詞：肝微粒體,，藥物-藥物相互作用（Drug-drug interaction, DDI）,，細(xì)胞色素P450酶（CytochromeP450，CYP450）,，時(shí)間依賴性抑制（Time-dependent inhibition,，TDI）

藥物-藥物相互作用（Drug-drug interaction, DDI）是臨床上產(chǎn)生嚴(yán)重不良反應(yīng)甚至死亡的主要原因之一，因此對DDI發(fā)生的可能性和嚴(yán)重性及其影響程度進(jìn)行科學(xué)評估是十分必要的,。細(xì)胞色素P450酶（CytochromeP450,，CYP450）是體內(nèi)重要的藥物代謝酶，其介導(dǎo)的藥物相互作用評估主要包括代謝表型研究,、酶誘導(dǎo)作用評估及酶抑制作用評估,。其中，藥物對于CYP450酶的抑制作用可分為可逆性抑制（Reversible Inhibition）和時(shí)間依賴性抑制（Time-dependent inhibition,，TDI）,。與可逆性抑制相比，TDI會帶來更嚴(yán)重的用藥安全問題,，因此逐年受到監(jiān)管機(jī)構(gòu)及藥物研發(fā)者的重視,。本期文章主要介紹CYP酶介導(dǎo)的時(shí)間依賴性抑制作用評估。

一,、CYP酶介導(dǎo)的時(shí)間依賴性抑制介紹

CYP酶介導(dǎo)的酶抑制是指某些化合物能抑制某種或部分CYP450代謝酶的活性,，導(dǎo)致聯(lián)合用藥時(shí)一些藥物出現(xiàn)代謝減慢、清除率降低及暴露量增加的現(xiàn)象,，從而造成安全隱患,。根據(jù)抑制的機(jī)制不同，藥物對于CYP450酶的抑制作用可分為可逆性抑制（Reversible Inhibition）和時(shí)間依賴性抑制（Time-dependent inhibition,，TDI）,。時(shí)間依賴性抑制又稱不可逆性抑制（Irreversible Inhibition），一般是指候選藥物經(jīng)CYP酶的代謝產(chǎn)物以共價(jià)鍵與酶形成復(fù)合物,，導(dǎo)致酶不可逆性失活,，抑制劑對酶的抑制效應(yīng)在除去抑制劑后不會即刻消失，而是呈現(xiàn)出時(shí)間依賴的特性,。

與可逆性抑制相比,，時(shí)間依賴抑制（TDI）的發(fā)生會帶來更為嚴(yán)重的用藥安全問題。聯(lián)合用藥的藥物如果受到TDI的影響,，可能會存在暴露量非線性增長,、血藥濃度大幅升高等后果,，給患者帶來嚴(yán)重的健康威脅。最著名的實(shí)例莫如抗高血壓藥米貝拉地爾（mibefradil）,，它是一種鈣離子T和L通道阻滯劑,，上市后出現(xiàn)了嚴(yán)重的不良反應(yīng)。最終經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),，米貝拉地爾是一種時(shí)間依賴性的抑制劑，對CYP3A4產(chǎn)生不可逆性抑制,，使聯(lián)合用的其他藥物血藥濃度大幅升高,，以致產(chǎn)生毒性，甚至造成患者死亡,，也因如此,，米貝拉地爾不得不從市場上退出。

由此可見,，TDI所造成的影響不僅給患者帶來嚴(yán)重的健康威脅,，對制藥企業(yè)也是巨大的挑戰(zhàn)和威脅，因此逐年受到監(jiān)管機(jī)構(gòu)及藥物研發(fā)者的重視,?！端幬锵嗷プ饔醚芯考夹g(shù)指導(dǎo)原則（試行）》和ICH指導(dǎo)原則《M12：藥物相互作用》中明確表示應(yīng)進(jìn)行在研藥物對7種常規(guī)的CYP同工酶CYP1A2、CYP2B6,、CYP2C8,、CYP2C9、CYP2C19,、CYP2D6和CYP3A4 產(chǎn)生的可逆性抑制和時(shí)間依賴性抑制（Time-dependent inhibition,，TDI）的體外試驗(yàn)評估。

二,、時(shí)間依賴性抑制體外試驗(yàn)評估

一般采用人肝微粒體作為體外孵育系統(tǒng)進(jìn)行在研藥物對于CYP450酶的時(shí)間依賴性抑制評估研究,。目前常規(guī)的TDI評估方法有Single-point法、IC50位移法（IC50 shift）和Kinact/Ki法,。

【Single-point法】

試驗(yàn)設(shè)計(jì)：一個(gè)或兩個(gè)試驗(yàn)濃度(通常1uM/10uM),一個(gè)探針底物濃度,；+/-NADPH預(yù)孵育一個(gè)時(shí)間點(diǎn)；粗糙的評估,，適合早期和高通量篩選,。

評價(jià)參數(shù)：相對剩余活性（% Remaining activity=（% of NC(+NADPH）/% of NC(-NADPH）)×100

評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：相對剩余活性＜80%，提示有潛在的TDI風(fēng)險(xiǎn)

【IC50位移法（IC50 shift）】

試驗(yàn)設(shè)計(jì)：系列試驗(yàn)濃度,，一個(gè)探針底物濃度,，+/-NADPH預(yù)孵育30min，以測定得到的IC50值進(jìn)行評估,；相對精準(zhǔn)的評估,，可用于進(jìn)行粗略的DDI預(yù)測,。

評價(jià)參數(shù)：IC50位移=IC50（30min pre-incubation,-NADPH) /IC50（30min pre-incubation,+NADPH)

評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：IC50位移≥1.5，提示在研藥物存在TDI,。

【Kinact/Ki法】

試驗(yàn)設(shè)計(jì)：系列試驗(yàn)濃度,，系列探針底物濃度，+/-NADPH預(yù)孵育多個(gè)時(shí)間點(diǎn),；精準(zhǔn)的測定手段,，可用于進(jìn)行DDI的更精準(zhǔn)預(yù)測。

評價(jià)參數(shù)：Kinact/Ki

評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：結(jié)合臨床PK數(shù)據(jù),，計(jì)算R2值評價(jià)臨床意義,。

目前使用比較廣泛的評估TDI效應(yīng)的方法為IC50 位移法，即設(shè)置系列抑制劑濃度,，在加和不加NADPH的情況下于37℃進(jìn)行預(yù)孵育,，預(yù)孵育時(shí)間一般為30 min（也可以設(shè)置0min預(yù)孵育組作為對照）；預(yù)孵育后,，加入含有NADPH的探針底物溶液,，終止反應(yīng)后，測定孵育液中底物代謝產(chǎn)物的生成量,，計(jì)算在0min預(yù)孵育和30min預(yù)孵育（加和不加NADPH情況下）IC50值,，比較IC50位移倍數(shù)，從而評價(jià)抑制劑是否具有時(shí)間依賴性抑制作用,。

三,、IPHASE時(shí)間依賴性抑制試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析

鑒于此，IPHASE作為體外研究生物試劑引-領(lǐng)者,，采用IC50位移法驗(yàn)證不同抑制劑對人肝微粒體CYP3A4酶的時(shí)間依賴性抑制（TDI）作用,。IPHASE技術(shù)人員將預(yù)孵育時(shí)間設(shè)定為0min和30min，抑制劑濃度分別設(shè)置為0μM,、0.0001μM,、0.001μM、0.01μM,、0.1μM,、1μM、10μM和100μM,。通過已知陽性底物睪酮被CYP3A4酶轉(zhuǎn)化為特異性代謝產(chǎn)物6β-羥基睪酮,，利用液相-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）檢測6β-羥基睪酮的生成量進(jìn)一步用于計(jì)算 IC50值。以下為結(jié)果數(shù)據(jù)分析：

1. 抑制劑無TDI作用

如圖所示,，在30min預(yù)孵育后,，NADPH（+）組的IC50=6.91μM，NADPH（-）組的IC50=8.76μM,，IC50位移倍數(shù)=IC50(30 min princubation, -NADPH)/IC50(30 min princubation, +NADPH)=8.76/6.91=1.27 ＜1.5,，且兩者相較于0 min孵育組的IC50值沒有明顯變化,，表明在研藥物對于CYP3A4酶沒有TDI作用。

2.抑制劑為NADPH依賴的TDI

此圖可以明顯看出,，在30min預(yù)孵育后,，NADPH（+）組的IC50曲線較NADPH（-）組和0min預(yù)孵育組有明顯的左移，其IC50位移倍數(shù)=12.43/0.63=19.73＞1.5,，但NADPH（-）組的IC50曲線和0min孵育組沒有明顯變化,，說明在研藥物對于CYP3A4酶具有NADPH依賴的TDI作用。

3. 抑制劑為無NADPH依賴的TDI

在實(shí)際操作中,，可能會遇到這樣一種情況：在30min預(yù)孵育后,，NADPH（+）組的IC50曲線較NADPH（-）組并沒有明顯的左移，如上圖所示,，IC50位移倍數(shù)=0.76/0.56=1.35＜1.5，似乎可以得出抑制劑對于CYP3A4酶沒有TDI作用的結(jié)論,。但圖中可以明顯看到經(jīng)過30min預(yù)孵育時(shí)間的NADPH（+）組和NADPH（-）組的IC50曲線較0min預(yù)孵育組的IC50曲線有明顯的左移,，說明抑制劑對于CYP3A4酶的抑制作用是呈時(shí)間依賴性的，但這種抑制作用并不依賴于NADPH,，也就是說,，在研藥物對于CYP3A4酶具有無NADPH依賴的TDI作用。

4. 抑制劑為NADPH依賴的酶代謝

第十四屆中國藥理學(xué)會藥物代謝專業(yè)委員會藥物和化學(xué)異物代謝學(xué)術(shù)會議,中國藥理學(xué)會藥物代謝專業(yè)委員會,藥物和化學(xué)異物代謝,化學(xué)異物代謝,藥物異物代謝

某次試驗(yàn)結(jié)束后,，試驗(yàn)人員在統(tǒng)計(jì)結(jié)果后發(fā)現(xiàn),，在30min預(yù)孵育后，NADPH（-）組的代謝情況和0min預(yù)孵育組的代謝情況基本一致,，但NADPH（+）組的IC50曲線較0min預(yù)孵育組的IC50曲線發(fā)生了右移,。針對這一“反常”情況,，我們分析抑制劑對于CYP3A4酶是可逆性抑制作用,，可以和底物與CYP3A4酶發(fā)生競爭性結(jié)合，并且在NADPH存在的情況下可能被微粒體中的某種酶代謝,，其代謝產(chǎn)物并不會對CYP3A4酶產(chǎn)生抑制作用,。抑制劑在NADPH存在的情況下經(jīng)過30min預(yù)孵育后，其代謝量較0min預(yù)孵育組多,，原藥本身剩余量更少,，對于CYP3A4酶的抑制作用較0min預(yù)孵育組弱，因此IC50值變大,，其IC50曲線發(fā)生了右移,。因此，我們判斷,，在該組試驗(yàn)中,，抑制劑可能發(fā)生了NADPH依賴的酶代謝,。

5. 抑制劑為非NADPH依賴的酶代謝

如圖所示，在30min預(yù)孵育后,，NADPH（-）組和NADPH（+）組的IC50曲線基本一致,，但相比0min預(yù)孵育組的IC50曲線均發(fā)生了右移，該情況和上面第4種情況類似,，抑制劑可能發(fā)生了酶代謝,，但該代謝過程是不依賴于NADPH的。也就是說,，在30min預(yù)孵育時(shí),，NADPH（-）組和NADPH（+）組的抑制劑均發(fā)生了酶代謝，且兩組間的代謝情況相似,。在整個(gè)試驗(yàn)過程中,，30min預(yù)孵育組的抑制劑較0min預(yù)孵育組酶代謝增多，對于CYP3A4酶的抑制作用減弱,，因此IC50值變大,，其IC50曲線發(fā)生了右移。因此,，我們判斷,，在該組試驗(yàn)中，抑制劑可能發(fā)生了非NADPH依賴的酶代謝,。

四,、IPHASE相關(guān)產(chǎn)品

藥物相互作用是新藥研發(fā)重要的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，而CYP酶介導(dǎo)的時(shí)間依賴性抑制作用評估是藥物相互作用評估重要的組成部分,。鑒于此,，IPHASE作為體外研究生物試劑引-領(lǐng)者，憑借先進(jìn)的設(shè)備,，專業(yè)的技術(shù)人員和多年研發(fā)的經(jīng)驗(yàn),，開發(fā)出人、猴,、犬,、大鼠、小鼠,、豬,、兔等多個(gè)種屬純度高、活性好的肝微粒體產(chǎn)品,，助力廣大客戶進(jìn)行CYP酶介導(dǎo)的TDI及其他方向的研究,。

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參考資料：

[1] 謝珊珊，王盼,，郭建軍,，等. 細(xì)胞色素P450酶的時(shí)間依賴性抑制研究及其在新藥研發(fā)中的作用[J]．中國新藥與臨床雜志，2013, 32(6): 419-425.

[2] ICH指導(dǎo)原則《M12：藥物相互作用》. 2024.

[3] NMPA. 藥物相互作用研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）.2021.

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