背景與挑戰(zhàn)

1.1 神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療需求：

神經(jīng)系統(tǒng)疾病是全球致殘的首要原因,，也是第二大死亡原因。其中,，中風(fēng)和癡呆（包括阿爾茨海默?。┦侵饕闹滤涝蛑弧＝陙?，核酸療法（如mRNA蛋白替代療法或基因編輯療法）開始被探索用于治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病,。例如，有研究使用血紅素加氧酶1（HO1）自復(fù)制mRNA治療缺血性中風(fēng),，以及使用腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）mRNA治療阿爾茨海默病,。

1.2 血腦屏障的限制：

血腦屏障（BBB）是大腦的天然保護(hù)屏障,，由腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、基底膜,、星形膠質(zhì)細(xì)胞和周細(xì)胞組成,。BBB阻止了約98%的小分子藥物和幾乎100%的大分子藥物進(jìn)入大腦。因此,，LNP必須穿越這一高度選擇性的屏障才能到達(dá)大腦,。然而，目前缺乏高效遞送載體的原因之一是缺乏信息豐富的體外篩選平臺(tái),。

圖示靜脈給藥后LNP-RNA的體內(nèi)分布

高通量篩選平臺(tái)的開發(fā)

2.1 HTS-BBB平臺(tái)的構(gòu)建：

為了解決上述問題,，Mike Mitchell Lab開發(fā)了一個(gè)用于高通量篩選mRNA LNP的血腦屏障轉(zhuǎn)運(yùn)模型（HTS-BBB）。該模型建立在96孔Transwell板上,，每個(gè)孔由生長(zhǎng)在半透膜上的腦內(nèi)皮單層組成,，將頂室（代表血液側(cè)）和基底外側(cè)室（代表腦側(cè)）分開。這種設(shè)計(jì)允許同時(shí)評(píng)估LNP的轉(zhuǎn)染效率和跨單層的轉(zhuǎn)運(yùn)效率,。

圖1：血腦屏障（BBB）的生理學(xué)示意圖,，以及高通量篩選血腦屏障平臺(tái)（HTS-BBB）的開發(fā)，該平臺(tái)用于識(shí)別能夠穿越并轉(zhuǎn)染血腦屏障,、適用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療的mRNA脂質(zhì)納米顆粒（mRNA LNPs）,。

2.2 優(yōu)化腦內(nèi)皮單層細(xì)胞生長(zhǎng)條件：

研究人員選擇了永生化人微血管腦內(nèi)皮細(xì)胞（hCMEC/D3）作為細(xì)胞系，因?yàn)樗鼈冊(cè)?型膠原蛋白（BBB基底膜的關(guān)鍵成分）上生長(zhǎng)時(shí),，能夠形成具有接觸抑制特性的單層細(xì)胞,，并表達(dá)緊密連接和粘附連接，從而有助于調(diào)節(jié)BBB的結(jié)構(gòu)完整性和滲透性,。例如,，在96孔Transwell板上，hCMEC/D3細(xì)胞以30000 cells/cm2的密度接種,，6天后形成完整的單層,。研究人員通過活/死成像技術(shù)監(jiān)測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，并使用共聚焦顯微鏡分析單層的完整性,。此外,，研究人員還檢測(cè)了單層對(duì)FITC-葡聚糖的轉(zhuǎn)運(yùn)能力，結(jié)果顯示10 kDa和70 kDa的FITC-葡聚糖的轉(zhuǎn)運(yùn)率分別為5%和2%,，表明單層具有高度的結(jié)構(gòu)完整性和選擇性通透性,。

2.3 優(yōu)化轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)運(yùn)報(bào)告系統(tǒng)：

為了同時(shí)評(píng)估LNP的轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)運(yùn)效率,，研究人員制備了含有熒光素酶（Luciferase）mRNA的LNP,，并添加了1%的親脂性染料DiR。熒光素酶mRNA用于評(píng)估LNP的轉(zhuǎn)染效率,，而DiR用于追蹤LNP的轉(zhuǎn)運(yùn),。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,，Luciferase的發(fā)光信號(hào)比mCherry熒光信號(hào)更為靈敏。研究人員還發(fā)現(xiàn),，DiR的摩爾比對(duì)LNP的轉(zhuǎn)染能力有顯著影響,，1%的DiR摩爾比是最核實(shí)條件。此外,，研究人員還評(píng)估了不同處理時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)染效率的影響,，發(fā)現(xiàn)24小時(shí)的信號(hào)強(qiáng)度顯著高于6小時(shí)，表明更長(zhǎng)的處理時(shí)間有助于mRNA的翻譯,。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果與驗(yàn)證

為了驗(yàn)證HTS-BBB平臺(tái)的預(yù)測(cè)性，研究人員將篩選出的LNP包封Luc-mRNA,，按照0.3 mg/kg mRNA劑量靜脈注射到小鼠體內(nèi),。檢測(cè)結(jié)果顯示，LNP4和LNP10在大腦中的熒光信號(hào)最高,，其中LNP4的熒光信號(hào)強(qiáng)度超過LNP3的1000倍,。此外，注射LNP4的小鼠大腦熒光強(qiáng)度占總熒光強(qiáng)度的1%,，而注射LNP3的小鼠大腦熒光強(qiáng)度僅占0.2%,。

研究意義與展望

總結(jié)

參考文獻(xiàn)：Han EL, Padilla MS, Palanki R, Kim D, Mrksich K, Li JJ, Tang S, Yoon IC, Mitchell MJ. Predictive High-Throughput Platform for Dual Screening of mRNA Lipid Nanoparticle Blood-Brain Barrier Transfection and Crossing. Nano Lett. 2024 Feb 7;24(5):1477-1486. doi: 10.1021/acs.nanolett.3c03509. Epub 2024 Jan 23. PMID: 38259198.