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實時熒光定量PCR儀的基本原理是利用DNA聚合酶在PCR過程中合成新DNA鏈的特性,，結(jié)合一種熒光標記的探針或染料，通過實時監(jiān)測熒光信號的增加來測量PCR反應的進行程度,。在PCR反應體系中加入熒光基因,，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程,。隨著反應時間的進行,，監(jiān)測到的熒光信號的變化可以繪制成一條曲線,。
由于在PCR擴增的指數(shù)時期，模板的Ct值(即樣品到達域值水平所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關系,，所以可以作為定量的依據(jù),。域值應設定在使指數(shù)期的擴增效率為最大，這樣可以獲得最準確,、可重復性的數(shù)據(jù),。如果同時擴增的還有標有相應濃度的標準品，線性回歸分析將產(chǎn)生一條標準曲線,，可以用來計算未知樣品的濃度。
使用實時熒光定量PCR儀的一般操作流程包括：
設計引物和探針：根據(jù)實驗目的,，選擇合適的基因序列,，設計特異性引物和熒光探針。
準備樣本：提取待檢測的核酸樣本,，如DNA或RNA,，并確保樣本的質(zhì)量和純度。
準備反應體系：將所需的試劑和樣本加入PCR反應管中,，組成反應體系,。包括引物、探針,、酶,、緩沖液、dNTPs和核酸模板等,。
設置儀器參數(shù)：打開儀器,，選擇合適的PCR程序，并根據(jù)實驗要求設置溫度,、時間,、循環(huán)次數(shù)等參數(shù)。同時,，設置熒光檢測通道和參數(shù),。
放置樣本：將準備好的PCR反應管放入儀器的樣品槽中，確保放置正確且穩(wěn)固,。
啟動程序：確認設置無誤后,，啟動PCR程序,。儀器將按照設定參數(shù)進行溫度循環(huán)和熒光檢測。
實時監(jiān)測與分析：通過儀器顯示屏實時監(jiān)測熒光信號變化,，觀察擴增曲線形狀和趨勢,。實驗結(jié)束后，儀器自動生成結(jié)果,，包括擴增曲線,、Ct值等。使用軟件對結(jié)果進行分析和處理,。
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