Western Blot 常見問題及解決方案

來源：南京億迅生物科技有限公司 2025年02月08日 17:04

一,、背景過高

原因：

封閉不充分；一抗過濃,；孵育溫度過高,；一抗二抗封閉劑間有交叉反應(yīng),；洗膜不充分；膜過于干燥

方案：

延長封閉時(shí)間或更換封劑,；稀釋一抗,；4℃孵育；加入Tween-20,，以減少交叉反應(yīng),；設(shè)二抗對照，稀釋二抗,；增加洗膜次數(shù),；避免干膜

二、無條帶或太弱

原因：

一抗二抗選擇錯(cuò)誤,；一抗二抗?jié)舛冗^低,；一抗失效,；蛋白含量過低；轉(zhuǎn)膜不充分或洗膜過度,；過度封閉,；二抗受疊氛鈉抑制；底物與酶失效,；曝光時(shí)間過短

方案：

選擇正確抗體,；檢查抗體和顯色試劑盒保質(zhì)期；提高樣品蛋白含量,；設(shè)內(nèi)參對照,，轉(zhuǎn)膜對照；轉(zhuǎn)膜效果的檢查,；減少洗膜時(shí)間

降低封閉液濃度,，減少封閉時(shí)間；延長曝光時(shí)間

三,、雜帶過多

原因：

蛋白樣本具有多種修飾,；蛋白樣本降解；蛋白存在二聚體或多聚體,；一抗二抗?jié)舛冗^高,；多克隆抗體

方案：

使用去修飾的試劑；使用蛋白酶抑制劑,；電泳上樣前,，煮沸10 min，以增強(qiáng)蛋白質(zhì)解聚變性,；降低抗體濃度,；選用單克隆抗體

四、其他問題

1.背景白色條帶 → 轉(zhuǎn)膜時(shí)有氣泡或抗體分布不均

2.暗片現(xiàn)白條帶 → 一抗或二抗加入過多

3.目的條帶過低/過高 → 膠濃度不合適

4.“微笑"條帶 → 遷移過快,、電泳溫度過高

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