本文要點(diǎn)：本文報(bào)道了一種H2S2介導(dǎo)形成反應(yīng),?；谶@一反應(yīng),，研究者構(gòu)建了第一個(gè)NIR-II熒光（FL）和光聲（PA）雙比率探針（NIR-II-H2S2）,，用于在體內(nèi)可視化定量H2S2,。該探針對(duì)Na2S2物種顯示出雙比率NIR-II熒光（I840/I1000，107倍）和光聲（PA800/PA900,，6.5倍）響應(yīng),，具有高特異性、優(yōu)異的靈敏度（1.8 nM）,、改善的水溶性和深層組織滲透性,。更重要的是，使用NIR-II雙比率FL/PA成像,，成功證明該探針可用于準(zhǔn)確量化脂多糖或二甲雙胍藥物誘導(dǎo)的肝損傷小鼠模型中波動(dòng)的H2S2水平,。總的來說，這項(xiàng)研究不僅為H2S2相關(guān)的病理研究提供了一種有前景的工具,，還提供了一個(gè)識(shí)別位點(diǎn),，可以推廣到未來設(shè)計(jì)更有用的H2S2成像劑。

動(dòng)物活體成像

方案1. NIR-II FL/PA 雙比率探針NIR-II-H2S2用于定量可視化H2S2基于新發(fā)現(xiàn)的 H2S2-介導(dǎo)的二硫醇形成反應(yīng),。

如方案1所示,，NIR-II FL/PA雙比率探針NIR-II-H2S2包含用作信號(hào)傳感器的NIR-II花青熒光團(tuán)支架和用作H2S2識(shí)別位點(diǎn)的1,3-二氯部分。該探針通過自校準(zhǔn)的雙比率NIR-II FL/PA讀數(shù)顯示出高特異性和敏感性,、水溶性和對(duì)H2S2的實(shí)質(zhì)性深層組織滲透,。這項(xiàng)研究代表了H2S2探針開發(fā)的重大進(jìn)步，因?yàn)橹皥?bào)道的H2Sn探針無法準(zhǔn)確區(qū)分不同的H2Sn物種,。此外,，利用雙比值NIR-II FL/PA成像，研究者成功證明該探針可以準(zhǔn)確量化脂多糖（LPS）/二甲雙胍（MET）誘導(dǎo)的肝毒性小鼠模型中H2S2水平的波動(dòng),；H2S2的變化水平與胱硫醚γ-裂解酶（CSE）的變化水平一致,。總的來說,，這種NIR-II FL/PA雙比值探針可以為復(fù)雜生物系統(tǒng)中與H2S2相關(guān)的病理研究提供強(qiáng)有力的工具,，新發(fā)現(xiàn)的1,3-二氯識(shí)別位點(diǎn)可以推廣用于下一代精確H2S2成像劑的設(shè)計(jì)。

隨后,，為了將探針應(yīng)用于體內(nèi)成像,，使用UV/Vis吸收、熒光和PA光譜研究了NIR-II-H2S2對(duì)H2S2的雙比率NIR-II FL/PA響應(yīng),。NIR-II-H2S2在PBS/EtOH（7/3,，v/v）中的UV/Vis吸收如圖1a所示。隨著H2S2（此處,，Na2S2充當(dāng)H2S2的供體）濃度的增加,，以900 nm為中心的吸收峰減小，而在800 nm處出現(xiàn)了新的吸收信號(hào),。值得注意的是,，圖1d中觀察到強(qiáng)烈的線性相關(guān)性，表明NIR-II-H2S2可以作為H2S2的比色探針,。此外,，測量了不同濃度H2S2的熒光滴定光譜，顯示在1000 nm處的發(fā)射峰降低,，在840 nm處出現(xiàn)了一個(gè)新的發(fā)射峰（圖1b和1c）,。約160nm的大發(fā)射偏移和良好分離的雙發(fā)射帶表明NIR-II-H2S2對(duì)H2S2具有優(yōu)異的NIR-II熒光比率響應(yīng)行為。熒光強(qiáng)度比（I840/I1000）提高了約107倍,，并與H2S2濃度呈線性關(guān)系（圖1e）,?；跓晒獗龋褂肗IR-II-H2S2計(jì)算出的H2S2檢測限（3σ/k）約為1.8nM,，可以在相對(duì)較低的濃度下有效檢測H2S2,。

NIR-II-H2S2可用于在復(fù)雜的生物系統(tǒng)中選擇性地檢測H2S2活性（圖1g）。與吸收光譜中觀察到的變化類似,，NIR-II-H2S2探針的光聲光譜在添加Na2S2后逐漸藍(lán)移,。比色傳感行為表明，該探針可能實(shí)現(xiàn)H2S2的比率光聲檢測,。此外,，NIR-II-H2S2溶液的PA成像顯示，用Na2S2滴定時(shí),，著Na2S2從0增加到80μM,，PA800/PA900幾乎線性地從約0.91±0.02增加到5.91±0.09。此外,，PA強(qiáng)度比（PA800/PA900）增加了約6.5倍（圖1f）,。NIR-II比率熒光增強(qiáng)（I840/I1000）明顯大于PA比率（PA800/PA90）增強(qiáng)，表明熒光成像的靈敏度可能優(yōu)于PA成像,。

此外,，體外PA選擇性實(shí)驗(yàn)表明，干擾物種沒有引起PA800/PA900的顯著變化（圖1h）,，這與熒光選擇性結(jié)果一致（圖1g）,。因此，NIR-II-H2S2在雙比率NIR-II FL/PA檢測中表現(xiàn)出優(yōu)異的H2S2特異性,。隨后,，對(duì)添加Na2S2后I840/I1000比值隨時(shí)間的變化進(jìn)行跟蹤，結(jié)果表明NIR-II- H2S2與H2S2反應(yīng)迅速,，并在8分鐘內(nèi)達(dá)到飽和（圖1i）,。此外，還研究了pH值對(duì)NIR-II- H2S2與H2S2反應(yīng)的影響,。結(jié)果表明,，NIR-II-H2S2適合通過NIR-II FL/PA雙比值模式在體外捕獲H2S2。

實(shí)現(xiàn)足夠的信號(hào)穿透一直是體內(nèi)熒光成像的一個(gè)挑戰(zhàn),，特別是在研究體內(nèi)深處的生物結(jié)構(gòu)時(shí)。為了評(píng)估NIR-II- H2S2的組織穿透能力,，使用含有NIR-II-H2SO4（NIR-II染料的代表）或Cy-Cl（NIR-I染料的代表）的毛細(xì)管進(jìn)行了脂肪乳劑體模成像,，該毛細(xì)管在體模深度浸入1%的脂肪乳劑溶液中，作為組織的模擬（圖2a）,。如圖2a所示,，即使在7mm的浸沒深度下,，NIR-II-H2S2在NIR-II區(qū)域（>1000nm）的管邊界也清晰可辨，而Cy-Cl在NIR-I區(qū)域的管邊界則顯得模糊且無法區(qū)分,。NIR-II-H2S2（7mm）的穿透深度幾乎是Cy-Cl（1mm）的七倍,。此外，在模擬生物組織的5mm深度處,，NIR-II-H2S2的信噪比（SBR）（約11.3）比Cy-Cl（約1.1）高出約十倍（圖2b）,。這些結(jié)果表明，NIR-II-H2S2具有更高的成像分辨率和對(duì)比度,，適用于體內(nèi)深組織成像應(yīng)用,。

為了評(píng)估NIR-II- H2S2在體外檢測H2S2的潛力，研究者最初在離心管中進(jìn)行了NIR-II FL/PA雙比值成像實(shí)驗(yàn)（圖2). 在沒有Na2S2的情況下,，NIR-II-H2S2的NIR-II熒光成像比值在0至30分鐘內(nèi)隨時(shí)間變化最小,，保持在約1.82±0.05的值（圖2c和2d）。在圖2e和2f中,，添加Na2S2后,，相應(yīng)的熒光比隨時(shí)間從1.81±0.03上升到6.92±0.06，大約增加了3.8倍,。同樣,，圖2g-2i顯示，NIR-II-H2S2單獨(dú)的PA信號(hào)比保持穩(wěn)定在0.92±0.03左右,；然而,，隨著Na2S2的引入，PA的比例增加了一倍多,，上升到2.20,。結(jié)果表明，添加Na2S2的試管中NIR-II FL/PA比值發(fā)生了顯著變化,，從而證實(shí)了NIR-II-H2S2在體外檢測H2S2的有效性,。

圖3. 小鼠腹腔中NIR-II- H2S2 的NIR-II熒光-光聲比率成像

隨后，為了評(píng)估NIR-II-H2S2作為檢測外源性H2S2的化學(xué)工具的體內(nèi)檢測能力,，將探針和Na2S2注入小鼠腹腔（圖3）,。在30分鐘內(nèi)監(jiān)測探針的NIR-II熒光和PA雙比值信號(hào)的變化。成像結(jié)果表明,，在注射探針和生理鹽水后,，NIR-II比率信號(hào)強(qiáng)度（I850/I1000）沒有顯示出明顯的變化（圖3a和3d）。相比之下,，在注射探針和外源性Na2S2后（圖3b）,，NIR-II FL信號(hào)強(qiáng)度在850 nm處隨著時(shí)間的延長而增加，而在1000 nm處觀察到減少,，F(xiàn)L強(qiáng)度迅速增加,，在20分鐘內(nèi)達(dá)到平穩(wěn),。NIR-II比值信號(hào)強(qiáng)度（I850/I1000）從0.83±0.02增加到1.94±0.01，約為2.33倍,。此外,，比率PA成像顯示了類似的趨勢。作為比較,，僅施用探針后,，小鼠在兩個(gè)通道（PA800和PA900）上的PA強(qiáng)度沒有顯著變化。然而,，如圖3e所示,，在與Na2S2相互作用后，PA比值信號(hào)（PA800/PA900）從0.90±0.02增加到1.51±0.03,，大約增強(qiáng)了1.70倍,。三維多光譜光聲斷層掃描（3D MSOT）圖像進(jìn)一步證實(shí)，外源性H2S2在小鼠腹腔內(nèi)的相對(duì)位置可以在體內(nèi)特異性和直接觀察到（圖3g和3h）,。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了NIR-II-H2S2可以通過NIR-II-FL/PA雙比值成像在體內(nèi)有效地顯示外源性H2S2的發(fā)現(xiàn),。

圖4. 肝損傷中NIR-II-H2S2 的NIR-II熒光-光聲比率成像

選擇BALB/c裸鼠建立小動(dòng)物模型，用于鑒定肝損傷期間的H2S2水平,。圖4中描繪的小鼠分為五組,。最初，三組LPS處理的小鼠腹腔注射不同劑量的LPS以誘導(dǎo)肝損傷（圖4a） 注射生理鹽水和炔丙基甘氨酸（PAG,，一種CSE抑制劑）的小鼠分別作為對(duì)照組和抑制組,。隨后，通過尾靜脈給藥NIR-II-H2S2進(jìn)行體內(nèi)NIR-II-FL比率成像,。與對(duì)照組相比,，LPS治療組的850 nm LP圖像在0至30分鐘內(nèi)肝臟區(qū)域顯示出顯著的NIR-II熒光增強(qiáng)，而1000 nm LP圖像顯示出逐漸減弱,。此外,，相應(yīng)的NIR-II FL比率測量信號(hào)（I850/I1000）在20分鐘（探針富集15分鐘后開始的時(shí)間）達(dá)到最大值。20分鐘時(shí)獲得的定量數(shù)據(jù)顯示,，隨著LPS劑量的增加,，肝臟中的I850/I1000比值增加了約2倍，從0.88±0.03增加到1.76±0.02（圖4b,、4d-f）,，表明肝損傷中H2S2水平很高。在PAG抑制組中,，觀察到850 nm LP信號(hào)的強(qiáng)度降低,，NIR-II FL比率信號(hào)（I850/I1000）降低到對(duì)照組中觀察到的水平（圖4d和4f）。

接下來，在LPS誘導(dǎo)的肝損傷后,，使用多光譜光聲斷層掃描（MSOT）系統(tǒng)對(duì)LPS誘導(dǎo)的內(nèi)源性H2S2上調(diào)的NIR-II-H2S2進(jìn)行實(shí)時(shí)比率PA成像。PA成像的實(shí)驗(yàn)條件和模型與NIR-II比率FL實(shí)驗(yàn)相同,。對(duì)20分鐘內(nèi)采集的成像數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步分析（圖4c,，4 g–i）顯示PA800/PA900比值從0.93±0.03急劇增加到1.96±0.08，約為2.11倍,。同時(shí)還觀察到,，在抑制組中，PA比值信號(hào)降至對(duì)照組的水平,。腹腔注射LPS 12小時(shí)后,，小鼠血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）的水平逐漸升高（圖4j和4l）。不同劑量LPS治療前后肝組織切片的H&E染色也顯示,，隨著LPS劑量的增加,，肝損傷程度相應(yīng)增加（圖4k）。通過血清生物標(biāo)志物檢測和組織學(xué)分析獲得的結(jié)果與體內(nèi)NIR-II FL/PA雙比值成像結(jié)果一致,。這些發(fā)現(xiàn)表明,，NIR-II-H2S2適用于實(shí)時(shí)NIR-II FL/PA雙比值成像，以檢測LPS誘導(dǎo)的肝損傷過程中產(chǎn)生的H2S2,，并有望成為研究H2S2相關(guān)病理和治療機(jī)制的有效工具,。

圖5. MET誘導(dǎo)的小鼠肝損傷模型和成像實(shí)驗(yàn)

為了進(jìn)一步評(píng)估NIR-II-H2S2在內(nèi)源性H2S2體內(nèi)NIR-II FL/PA雙比值成像中的潛力，建立了MET誘導(dǎo)的肝毒性模型,，并將小鼠隨機(jī)分為五組（圖5a）,。正如預(yù)期的那樣，靜脈注射NIR-II-H2S2后,，實(shí)時(shí)NIR-II FL成像顯示,，MET治療組在小鼠肝臟區(qū)域的850 nm通道附近顯示出強(qiáng)烈的NIR-II熒光信號(hào)，在1000 nm通道處顯示出相對(duì)較弱的信號(hào)（圖5b）,。相比之下,，在抑制組中，與MET處理組相比,，觀察到850nm通道減少,，1000nm通道增加。有趣的是,，NIR-II FL比率圖像表明,，隨著MET濃度的升高，比率FL信號(hào)（I850/I1000）顯著增加,，從0.81±0.04增加到1.73±0.06（圖5c）,，這意味著MET誘導(dǎo)的H2S2生成的檢測非常可靠,。同時(shí),，比率PA成像進(jìn)一步顯示,，PA比率（PA800/PA900）從正常小鼠肝臟中的1.00±0.02增加到MET治療組肝臟中的2.21±0.05（圖5d和5h），約為2.21倍,。與正常組相比,，MET治療的小鼠血清中ALT和AST水平逐漸升高（圖5g和5i），證實(shí)了MET過量引起的不同程度的肝毒性,。同時(shí),，不同劑量MET治療前后肝組織的H&E染色也表明，隨著MET劑量的增加,，肝損傷程度相應(yīng)增加（圖5e）,。至關(guān)重要的是，通過血清生物標(biāo)志物檢測或組織學(xué)分析獲得的結(jié)果與FL/PA成像結(jié)果和CSE蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果一致（圖5f）,。本研究應(yīng)用NIR-II FL/PA雙比值成像探針闡明H2S2與LPS/MET誘導(dǎo)的肝毒性之間的關(guān)系,，從而為H2S2水平的體內(nèi)定量可視化和探索H2S2在炎癥性疾病中的相關(guān)作用提供了有利的分子工具。

總之,，基于新發(fā)現(xiàn)的H2S2介導(dǎo)形成反應(yīng),，本文成功構(gòu)建了NIR-II FL/PA雙比值探針NIR-II-H2S2，用于體內(nèi)內(nèi)源性H2S2的定量檢測和可視化,。這種反應(yīng)對(duì)Na2S2顯示出選擇性,，而其他生物RSS（包括GSH、Cys,、Hcy,、Na2S、Na2S4和S8）則沒有發(fā)生這種反應(yīng),。研究者們設(shè)計(jì)的探針NIR-II-H2S2由一個(gè)用作信號(hào)報(bào)告單元的NIR-II熒光團(tuán)支架和一個(gè)用作識(shí)別位點(diǎn)的新型1,3-二氯部分組成,。體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，探針NIR-II-H2S2能夠?qū)a2S2物種產(chǎn)生雙比率NIR-II FL（I840/I1000,，107倍）和PA（PA800/PA900,，6.5倍）反應(yīng)，具有高特異性,、優(yōu)異的靈敏度,、改善的水溶性和深層組織滲透性。這一進(jìn)展也標(biāo)志著H2S2探針開發(fā)的實(shí)質(zhì)性改進(jìn),，因?yàn)橹皥?bào)道的H2Sn探針無法準(zhǔn)確區(qū)分深部組織中的不同H2Sn物種,。此外，憑借NIR-II FL/PA雙比值成像的互補(bǔ)優(yōu)勢,，研究者成功地證明了該探針可以精確量化肝損傷小鼠深部肝組織中H2S2水平的波動(dòng),。目前，這是使用NIR-II FL/PA雙比值探針NIR-II-H2S2闡明H2S2與LPS/MET誘導(dǎo)的肝毒性之間的關(guān)系。因此,，本研究為理解H2S2在生命系統(tǒng)中的生物學(xué)功能提供了一種實(shí)用且有前景的工具,。新發(fā)現(xiàn)的1,3-二氯識(shí)別位點(diǎn)可以促進(jìn)用于各種生物應(yīng)用的下一代H2S2成像劑的設(shè)計(jì)。

參考文獻(xiàn)

Hu B, Liu Q, Jiang Y, et al. NIR‐II Fluorescence/Photoacoustic Dual Ratiometric Probes with Unique Recognition Site for Quantitatively Visualizing H2S2 in Vivo[J]. Angewandte Chemie, 2024: e202418378.