PCR引物設(shè)計(jì)的目的是為了找到一對(duì)合適的核苷酸片段,，使其能有效地?cái)U(kuò)增模板DNA序列,。因此，引物的優(yōu)劣直接關(guān)系到PCR的特異性與成功與否,。要設(shè)計(jì)引物首先要找到DNA序列的保守區(qū),。同時(shí)應(yīng)預(yù)測(cè)將要擴(kuò)增的片段單鏈?zhǔn)欠裥纬啥?jí)結(jié)構(gòu)。如這個(gè)區(qū)域單鏈能形成二級(jí)結(jié)構(gòu),，就要避開(kāi)它,。如這一段不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，那就可以在這一區(qū)域設(shè)計(jì)引物,。

        現(xiàn)在可以在這一保守區(qū)域里設(shè)計(jì)一對(duì)引物,。一般引物長(zhǎng)度為15~30堿基，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為100~600堿基對(duì),。讓我們先看看P1引物,。一般引物序列中G+C含量一般為40%~60%。而且四種堿基的分布最好隨機(jī),。不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在,。否則P1引物設(shè)計(jì)的就不合理,。應(yīng)重新尋找區(qū)域設(shè)計(jì)引物。

       同時(shí)引物之間也不能有互補(bǔ)性,，一般一對(duì)引物間不應(yīng)多于4個(gè)連續(xù)堿基的互補(bǔ),。引物確定以后，可以對(duì)引物進(jìn)行必要的修飾,，例如可以在引物的5′端加酶切位點(diǎn)序列,；標(biāo)記生物素、熒光素等,，這對(duì)擴(kuò)增的特異性影響不大,。但3′端絕對(duì)不能進(jìn)行任何修飾，因?yàn)橐锏难由焓菑?′端開(kāi)始的,。這里還需提醒的是3′端不要終止于密碼子的第3位,，因?yàn)槊艽a子第3位易發(fā)生簡(jiǎn)并，會(huì)影響擴(kuò)增的特異性與效率,。

綜上所述我們可以歸納十條PCR引物的設(shè)計(jì)原則：
①引物應(yīng)用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)并具有特異性,。
②產(chǎn)物不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。
③引物長(zhǎng)度一般在15~30堿基之間,。
④G+C含量在40%~60%之間,。
⑤堿基要隨機(jī)分布。
⑥引物自身不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ),。
⑦引物之間不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ),。
⑧引物5′端可以修飾。
⑨引物3′端不可修飾,。
⑩引物3′端要避開(kāi)密碼子的第3位,。

PCR引物設(shè)計(jì)的目的是找到一對(duì)合適的核苷酸片段，使其能有效地?cái)U(kuò)增模板DNA序列,。如前述,，引物的優(yōu)劣直接關(guān)系到PCR的特異性與成功與否。對(duì)引物的設(shè)計(jì)不可能有一種包羅萬(wàn)象的規(guī)則確保PCR的成功,，但遵循某些原則,，則有助于引物的設(shè)計(jì)。

1.  引物的特異性
引物與非特異擴(kuò)增序列的同源性不要超過(guò)70%或有連續(xù)8個(gè)互補(bǔ)堿基同源,。

2.  避開(kāi)產(chǎn)物的二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)
某些引物無(wú)效的主要原因是引物重復(fù)區(qū)DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響,，選擇擴(kuò)增片段時(shí)最好避開(kāi)二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域。用有關(guān)計(jì)算機(jī)軟件可以預(yù)測(cè)估計(jì)mRNA的穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu),，有助于選擇模板,。實(shí)驗(yàn)表明，待擴(kuò)區(qū)域自由能（△G°）小于58.6 lkJ/mol時(shí),，擴(kuò)增往往不能成功,。若不能避開(kāi)這一區(qū)域時(shí),，用7-deaza-2′-脫氧GTP取代dGTP對(duì)擴(kuò)增的成功是有幫助的。

3.  長(zhǎng)度
寡核苷酸引物長(zhǎng)度為15~30 bp,，一般為20~27mer。引物的有效長(zhǎng)度：Ln=2（G+C）+（A+T+,，Ln值不能大于38,，因?yàn)?gt;38時(shí)，最適延伸溫度會(huì)超過(guò)TaqDNA聚合酶的最適溫度（74℃),不能保證產(chǎn)物的特異性,。

4.  G+C含量
G+C含量一般為40%~60%,。其Tm值是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下,，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度,，有效啟動(dòng)溫度，一般高于Tm值5~10℃,。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估計(jì)引物的Tm值,，則有效引物的Tm為55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使復(fù)性條件最佳,。

5.  堿基礎(chǔ)隨機(jī)分布
引物中四種堿基的分布最好是隨機(jī)的,，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不應(yīng)超過(guò)3個(gè)連續(xù)的G或C,，因這樣會(huì)使引物在G+C富集序列區(qū)錯(cuò)誤引發(fā),。

6.  引物自身
引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，否則引物自身會(huì)折疊成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)牙引物本身復(fù)性,。這種二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)因空間位阻而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合,。若用人工判斷，引物自身連續(xù)互補(bǔ)堿基不能大于3bp,。

7.  引物之間
兩引物之間不應(yīng)不互補(bǔ)性,，尤應(yīng)避免3′端的互補(bǔ)重疊以防引物二聚體的形成。一對(duì)引物間不應(yīng)多于4個(gè)連續(xù)堿基的同源性或互補(bǔ)性,。

8.  引物的3′端
引物的延伸是從3′端開(kāi)始的,，不能進(jìn)行任何修飾。3′端也不能有形成任何二級(jí)結(jié)構(gòu)可能,，除在特殊的PCR（AS-PCR）反應(yīng)中,，引物3′端不能發(fā)生錯(cuò)配。

在標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體系中,，用2UTaqDNA聚合酶和800μmol/LdNTP（四種dNTP各200μmol/L）以質(zhì)粒（103拷貝）為模板,，按95℃，25s,；55℃,，25s,；72℃，1min的循環(huán)參數(shù)擴(kuò)增HIV-1gag基因區(qū)的條件下,，引物3′端錯(cuò)配對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的影響是有一定規(guī)律的,。A∶A錯(cuò)配使產(chǎn)量下降至1/20，A∶G和C∶C錯(cuò)七下降至1/100,。引物A：模板G與引物G：模板A錯(cuò)配對(duì)PCR影響是等同的,。

9.  引物的5′端
引物的5′端限定著PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度，它對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大,。因此,，可以被修飾而不影響擴(kuò)增的特異性。引物5′端修飾包括：加酶切位點(diǎn),；標(biāo)記生物素,、熒光、Eu3+等,；引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列,；引入突變位點(diǎn)、插入與缺失突變序列和引入一啟動(dòng)子序列等,。

10.  密碼子的簡(jiǎn)并
如擴(kuò)增編碼區(qū)域,，引物3′端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡(jiǎn)并,，會(huì)影響擴(kuò)增特異性與效率,。