“基因治療領(lǐng)域的發(fā)展極大地依賴于高效、安全的核酸遞送系統(tǒng)。脂質(zhì)納米顆粒(LNP)作為一種有前景的遞送載體,,在mRNA疫苗和療法中展現(xiàn)了巨大潛力,。然而,,針對特定器官(如肺部)的有效遞送仍面臨挑戰(zhàn),。本研究旨在利用高通量篩選技術(shù),,鑒定具有肺部靶向性的陽離子,、可降解類脂質(zhì)材料,。本文介紹了一種基于Barcode的高通量篩選系統(tǒng),用于鑒定具有肺部靶向效率的陽離子,、可降解類脂質(zhì)材料,。通過組合合成180種陽離子、可降解脂質(zhì),,并進行體內(nèi)外高通量篩選,,我們確定了多種在肺部有效遞送mRNA的脂質(zhì)納米顆粒(LNP)。其中,,LNP-CAD9在肺內(nèi)皮細胞中成功實現(xiàn)了基因編輯,,顯示出抗血管生成癌癥治療的潛力。”
圖一,、高通量LNP篩選技術(shù)促進肺靶向新型陽離子脂質(zhì)的開發(fā)流程示意圖
01
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材料與方法
1.1 脂質(zhì)合成與初步篩選:
研究團隊組合合成了180種陽離子,、可降解的脂質(zhì)(CAD脂質(zhì)),這些脂質(zhì)具有不同的化學結(jié)構(gòu),。
使用體外高通量篩選方法,,初步評估這些CAD LNP遞送mRNA的潛力,。
1.2 Barcode技術(shù)應(yīng)用:
從初步篩選中選出96種有潛力的CAD LNP,用于封裝Barcode DNA和螢火蟲熒光素酶(FLuc)mRNA,。
將這些LNP配方合并,,通過系統(tǒng)性給藥方式注入小鼠體內(nèi)。
利用深度測序技術(shù),,量化不同器官(心臟,、肝臟、脾臟,、肺和腎臟)中Barcode DNA的遞送和積累情況,。
1.3 候選LNP的進一步評估:
根據(jù)深度測序結(jié)果,,選出前4種在肺部具有最高遞送效率的LNP進行進一步評估,。
通過在小鼠體內(nèi)遞送FLuc mRNA,評估這些LNP在肺部的mRNA遞送效率,。
1.4 抗血管生成治療潛力評估:
選定最佳LNP配方(LNP-CAD9),,用于遞送CRISPR-Cas9系統(tǒng)和靶向VEGFR2的sgRNA至小鼠肺部。
評估LNP-CAD9在肺腫瘤模型中誘導VEGFR2基因敲除和抑制腫瘤生長的能力,。
02
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實驗結(jié)果
2.1 高通量篩選:
為了高效地篩選出具有肺部靶向能力的陽離子可降解脂質(zhì)類似物,,研究者們設(shè)計了一個基于Barcode DNA的高通量LNP篩選系統(tǒng)。這一系統(tǒng)使得在同一個動物體內(nèi)能夠同時評估多種納米顆粒,,從而極大地提高了篩選效率,。
研究者們首先合成了180種陽離子可降解脂質(zhì)(CAD脂質(zhì)),并通過體外高通量篩選初步評估了它們的遞送潛力,。在這一階段,,他們利用螢火蟲熒光素酶(FLuc)編碼的mRNA來研究CAD LNPs的遞送能力。
隨后,,從初步篩選出的CAD LNPs中選擇了96種,,用于封裝Barcode DNA和FLuc mRNA。將這些LNP制劑混合后,,通過系統(tǒng)給藥的方式注入小鼠體內(nèi),。利用深度測序技術(shù),研究者們能夠量化這些LNPs在各個器官(心臟,、肝臟,、脾臟、肺部和腎臟)中的積累情況,,從而識別出具有肺部靶向能力的CAD脂質(zhì)候選物,。通過體內(nèi)篩選,發(fā)現(xiàn)了21種在體內(nèi)具有肺部遞送能力的CAD LNP,,并進一步通過富集分析確定了LNP配方(LNP-CAD3,、LNP-CAD4,、LNP-CAD9和LNP-CAD10),這些配方能夠高效地將核酸貨物遞送到肺部,。
為了驗證Barcode DNA積累量能否準確反映CAD LNPs的mRNA遞送能力,,研究者們選擇了在肝臟中表現(xiàn)最佳的LNP-CAD20進行體內(nèi)FLuc mRNA遞送實驗。結(jié)果表明,,該LNP能夠在肝臟中特異性地表達熒光素酶,,這支持了高通量Barcode篩選結(jié)果的準確性。
2.2 構(gòu)效關(guān)系研究結(jié)果:
化學結(jié)構(gòu)與遞送效率的關(guān)系:
研究了CAD脂質(zhì)的化學結(jié)構(gòu)對其遞送效率的影響,。通過改變脂質(zhì)的化學特性(如離子化性質(zhì),、尾部結(jié)構(gòu)等),發(fā)現(xiàn)這些變化對LNP的遞送效率有顯著影響,。特定的化學結(jié)構(gòu)特征(如特定的離子化脂質(zhì)尾部結(jié)構(gòu))被發(fā)現(xiàn)能夠增強LNP對肺部的靶向性。
LNP的物理特性與遞送效率的關(guān)系:
研究了LNP的物理特性(如粒徑,、表面電荷等)對其遞送效率的影響,。通過調(diào)整這些物理特性,發(fā)現(xiàn)能夠進一步優(yōu)化LNP的遞送效率,。例如,,具有均勻固體核心形態(tài)的CAD LNP在遞送mRNA時表現(xiàn)出更高的效率。
圖二,、不同結(jié)構(gòu)CAD脂質(zhì)與體外細胞表達的構(gòu)效關(guān)系研究
圖三,、Barcode標記的96種不同陽離子LNP與體內(nèi)器官靶向分布的構(gòu)效關(guān)系研究
2.3 最佳LNP配方的確定:
體內(nèi)遞送效率:為了驗證這4種LNP配方的mRNA肺部遞送效率,,研究人員將含有螢火蟲熒光素酶(FLuc)mRNA的LNP-CAD3,、LNP-CAD4,、LNP-CAD9和LNP-CAD10以0.1mg/kg的劑量系統(tǒng)注射到C57BL/6J雌性小鼠體內(nèi),。通過生物發(fā)光成像技術(shù)確認,,這4種CAD LNPs均能夠按預期將mRNA遞送到肺部,。
與金標準系統(tǒng)的比較:為了評估LNP-CAD9的遞送潛能,研究人員還制備了一種金標準肺靶向MC3/DOTAP LNP系統(tǒng),,該系統(tǒng)已被FDA批準用于MC3LNP中的mRNA肺部遞送。比較結(jié)果顯示,,LNP-CAD9在肺部遞送效率方面顯著優(yōu)于MC3/DOTAP系統(tǒng)
圖四,、小鼠肺靶向LNP的優(yōu)選分子的評價與驗證
2.4 抗血管生成治療潛力:
除了評估CAD LNPs的遞送效率外,,研究者們還探索了它們在抗血管生成癌癥治療中的潛在應(yīng)用,。LNP-CAD9遞送Cas9 mRNA和靶向VEGFR2的sgRNA,,在4.0 mg/kg的劑量下有效誘導小鼠肺內(nèi)皮細胞的VEGFR2基因敲除。在肺腫瘤模型中,,LNP-CAD9表現(xiàn)出顯著的抗血管生成治療潛力,,能夠抑制腫瘤生長,其療效優(yōu)于金標準的肺趨向性MC3/DOTAP LNP系統(tǒng),。
圖五:CAD9 LNP敲除VEGFR2產(chǎn)生抗血管生產(chǎn)作用治療小鼠肺腫瘤的效果評價
03
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討論
本研究通過高通量篩選技術(shù),成功鑒定了具有肺部靶向性的陽離子,、可降解類脂質(zhì)材料,。LNP-CAD9作為其中的杰出者,在抗血管生成癌癥治療中展現(xiàn)出了巨大潛力,。高通量篩選技術(shù)的運用,,不僅加速了LNP的發(fā)現(xiàn)過程,還克服了基因治療應(yīng)用中肺部遞送的障礙,。
高通量篩選技術(shù)在本研究中的作用主要體現(xiàn)在以下幾個方面:
1.提高了篩選效率:通過自動化設(shè)備和先進的檢測方法,,高通量篩選技術(shù)能夠在短時間內(nèi)對大量化合物進行快速篩選,從而極大地提高了新藥發(fā)現(xiàn)的效率,。在本研究中,我們成功篩選了180種化學性質(zhì)不同的CAD LNP,,并確定了多種高效遞送LNP,。
2.增強了篩選準確性:高通量篩選技術(shù)具有高度的靈敏度和特異性,能夠準確識別出具有潛在生物活性的化合物,。在本研究中,,我們利用Barcode技術(shù),實現(xiàn)了對LNP體內(nèi)遞送效率的精確量化,,從而確保了篩選結(jié)果的準確性,。
3.拓展了應(yīng)用范圍:高通量篩選技術(shù)不僅適用于藥物研發(fā)領(lǐng)域,還可應(yīng)用于生物學研究,、器官篩查,、基因工程等多個方面。在本研究中,,我們成功將高通量篩選技術(shù)應(yīng)用于LNP的篩選和優(yōu)化,,為基因治療領(lǐng)域的發(fā)展提供了新的思路和方法。
參考文獻:Xue, Lulu, et al. "High-throughput barcoding of nanoparticles identifies cationic, degradable lipid-like materials for mRNA delivery to the lungs in female preclinical models." Nature Communications 15.1 (2024): 1884.
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