細胞培養(yǎng)技術(shù)：指的是細胞在體外條件下的生長,，在培養(yǎng)的過程中細胞不再形成組織（動物）,。
 
定義
培養(yǎng)物是單個細胞或細胞群,。細胞在培養(yǎng)時都要生活在人工環(huán)境中,，由于環(huán)境的改變,，細胞的移動或受一些其他因素的影響,，培養(yǎng)時間加長,，傳代導致細胞出現(xiàn)單一化型,。
 
在現(xiàn)代醫(yī)學和生物科學研究中應用廣泛
優(yōu)點
1.直接觀察活細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生命活動。用于細胞學,、遺傳學,、免疫學、實驗醫(yī)學和腫瘤學 等多種學科研究.
 
2.直接觀察細胞的變化可便于攝影,。
 
3.研究細胞種類如低等到高等到人類,、胚胎到成體、正常組織到腫瘤,。
 
4.便于使用各種技術(shù)：相差,、熒光、電鏡,、組化,、同位素標記等方法觀察和研究細胞狀況。
 
5.是分子生物學和基因工程學的研究對象,，也是其主要的組成部分,。
 
6.易于施用物理、化學生物的實驗研究,。
 
7.易于提供大量生物性狀相似的實驗對象,耗資少比較經(jīng)濟,。
 
8.成為生物制品單克隆抗體生產(chǎn)和基因工程等的材料來源。
缺點
組織和細胞離體后獨立生存在人工的培養(yǎng)環(huán)境中,，雖然模擬體內(nèi)環(huán)境,，仍有很大差異。 因而利用培養(yǎng)細胞做實驗時,，不應視為體內(nèi)細胞相同,，把實驗結(jié)果推測體內(nèi)，輕易做出與體內(nèi)等同的結(jié)論,。
細胞類型
細胞類型根據(jù)是否附于支持物上生長的特性,，分為: 貼附型 懸浮型
 
（一）貼附型
 
細胞貼附在支持物表面生長,，只依賴貼附才能生長的細胞叫做貼附型細胞(Anchorrage-dependent cells)這種現(xiàn)象與細胞分化有關(guān)。
 
貼附型細胞的分型
 
1.成纖維型細胞：(fibroblast) 來自中胚層
 
特點：與體內(nèi)成纖維細胞形態(tài)相似,胞體梭型或不規(guī)則三角形,中央有圓形核,胞質(zhì)向外伸出2～3個長短不同的突起,。細胞在生長時呈放射狀,漩渦或火焰狀走行,。
 
起源：細胞來自中胚層間充質(zhì)組織。
 
除真正的成纖維細胞,、心肌,、平滑肌、成骨細胞,、血管內(nèi)皮細胞,。
 
注意：細胞在培養(yǎng)時成為成纖維型細胞是一種慣稱,與體內(nèi)細胞不同。
 
2.上皮型細胞(epithlium cell type) 來自外胚層 特點：扁平不規(guī)則多角型,、圓形核,、細胞緊密相連成細胞增殖數(shù)目增多時,整個上皮膜隨之移動。邊緣細胞很少脫離細胞群而單獨活動“ 拉網(wǎng)”現(xiàn)象與起源內(nèi)外胚層組織有關(guān),。
 
組織: 皮膚表皮及其衍生物(汗腺,、皮脂腺)消化道分上皮、肝,、胰,、肺泡上皮。
 
3. 游走型細胞(wandering cell type)
 
特點：在支持物上散在生長,不連接成片,胞質(zhì)伸出偽足或突起呈活躍的游走或變形運動,速度快不規(guī)則, 密度大連接成片呈多角形不易與其他類型的細胞 區(qū)別,。
 
4. 多形型細胞 (polymorphic cell type)
 
特點： 無規(guī)律的形態(tài),，如神經(jīng)細胞。
 
懸浮型細胞(suspended cell type)
 
特點： 不貼附在支持物生長,，胞體圓形,，在培養(yǎng)液中生長空間大,，可長時間的生長,，繁殖旺盛便于做細胞代謝研究。S180肉瘤,、血液里的白細胞,、K562、 HL－60,。
 
分型的目的：
 
方便描述細胞在培養(yǎng)過程中的形態(tài)變化,。培養(yǎng)條件好時，細胞相對穩(wěn)定,，可反映出起源,、正常異常的區(qū)別，作為判定細胞生物學性狀指標,。
 
強調(diào)：一般形態(tài)并不是一項可靠指標要受各方面影響,。
 
如：反復開關(guān)溫箱,、溫度、C02的濃度,、培養(yǎng)基變堿,、支原體、pH值,。細胞在接種時呈三角型狀態(tài),，經(jīng)培養(yǎng)一定時間后，細胞在傳代前已形成上皮型細胞,。

細胞生長與增殖
培養(yǎng)細胞的生存環(huán)境是培養(yǎng)瓶,、器皿或其他容器，生存空間及營養(yǎng)是有限的,。當細胞增殖到一定密度后,，分離出一部分細胞和更新營養(yǎng)液，使細胞更好地生存,，這一過程稱之為“ 傳代”(passage或subculture),。 值得注意的是：每次傳代細胞在生長和增殖方面受到一定的影響
細胞生命期(life span of culture cells)
指細胞在培養(yǎng)過程中持續(xù)增殖和生長的時間。一般根據(jù)細胞種類,、性狀和原供體的年齡的情況而定,。
 
如：二倍體成纖維細胞，在不凍存和反復傳代條件下可傳30～50代,，相當于150～300個細胞增殖周期,，能維持一年左右的生命，細胞便開始凋亡(apoptosis),。 細胞在生存過程中經(jīng)歷以下三個階段
 
1.原代培養(yǎng)期(primary culture)
 
組織到第一次傳代 時間大約為1～4周
 
特點：
 
細胞活躍移動,分裂,但不旺盛多呈二倍體核型,。
 
原代與體內(nèi)原組織形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動基本相似。
 
各細胞的遺傳性狀互不相關(guān),，細胞相互依存性強,，如果把這種稀釋分散成單細胞,在軟瓊脂培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)細胞克隆的形成率(cloning efficiency)下降，表明細胞獨立生存性差,。
 
2.傳代期(passage)
 
初代培養(yǎng)細胞一經(jīng)傳代便稱之為細胞系(cell line)
 
特點：
 
細胞增殖旺盛,，并維持二倍體核型，也叫二倍體細胞系(diploid cell line)為了保存二倍體細胞性質(zhì),，細胞應在初代或傳代早期凍存為好,。
 
一般細胞在10代以內(nèi)凍存。
 
凍存配方：
 
向培養(yǎng)液加入保護劑二甲基亞砜(DMSO)或甘油,封入安瓶中,。
 
存于在液氮中溫度可達到－196℃,，可長期儲存。如解凍后細胞復蘇,，仍能繼續(xù)增殖生長,，細胞性狀不受影響,，成為保存細胞最主要的手段。
 
3.衰退期
 
特點：細胞仍生存 增殖減慢 不增殖 輪廓增強 衰退凋亡
 
注意：細胞在三期中的任何一期（一般發(fā)生在傳代后期或衰退期）在某些因素影響下,如血清質(zhì)量不佳,、病毒污染,、溫度和pH不穩(wěn)等,細胞可能發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化(spontaneous transformation);
 
細胞可能獲得永生性(immortality) 或稱為惡性性(malignancy)。細胞獲得持久性的增殖能力,這樣的細胞群體稱為連續(xù)細胞系(continuous cell line),。而細胞獲得不死性后,細胞核型大多變成異倍體(heteroploid)接觸抑制消失,。
培養(yǎng)細胞一代生存期
“ 一代”指細胞接種到分離再培養(yǎng)的所用的時間,。與細胞倍增一代不是一個含義,。在細胞一代中,，細胞能倍增3～6次，經(jīng)歷三個階段：
 
1. 潛伏期(latent phase) ：
 
接種 經(jīng)過 懸浮期(細胞質(zhì)回縮,胞體呈圓球形) 貼壁,。
 
初代培養(yǎng)細胞 經(jīng)過 10～24小時或更多時間,。
 
連續(xù)細胞系和癌細胞系 經(jīng)過 10～30分鐘 貼附。
 
貼附現(xiàn)象是一個非常復雜和受多種因素的影響,。
 
影響細胞貼附：底物表面不干凈,，影響細胞貼附。
 
利于細胞貼附：底物表面帶有陽性物質(zhì)與特殊物質(zhì):
 
纖粘連蛋白(fibronectin FN),、
 
細胞表面蛋白(cell surface proteinCSP)
 
這些物質(zhì)有的存在與細胞表面,有的來自血清,。
 
潛伏期特點：
 
長短與細胞接種密度、種類,、使用的培養(yǎng)基性質(zhì)有關(guān),。
 
(1)細胞貼附后進入潛伏期,細胞無增殖。少見分裂相,，細胞有運動活動,。
 
(2)初代培養(yǎng) 細胞潛伏期約為24～96小時或更長，
 
連續(xù)細胞系和腫瘤細胞潛伏期約6～24小時,。
 
(3)細胞接種密度大潛伏期短,。
 
(4)細胞出現(xiàn)分裂相增多時，標志細胞進入指數(shù)增生期,。
 
2．指數(shù)增生期(logarithmic growth phase)：
 
特點：細胞增殖最旺盛階段,分裂相增多,。
 
細胞分裂指數(shù)(mitotie index MI) ：
 
表示每1000個細胞中的分裂相數(shù),。
 
條件：分裂相數(shù)與細胞種類,、培養(yǎng)成分、pH培養(yǎng)箱溫度有關(guān),。
 
細胞分裂指數(shù)：
 
初代細胞：在0.1％～0.5％之間％ ,
 
連續(xù)分裂細胞和腫瘤細胞：3 ～5％,。
 
指數(shù)增生期是作為細胞一代活力較好時期,是進行實驗最好和最主要的階段。
 
指數(shù)增生期持續(xù)3～5天,，細胞數(shù)量增多后生長空間變小,，細胞相互接觸可連接成片,。
 
正常細胞：細胞相互接觸能抑制細胞運動，這種現(xiàn)象稱為接觸抑制(contact inhibition),。
 
腫瘤細胞：沒有這種現(xiàn)象,，可作為區(qū)別正常與腫瘤細胞的標志之一。當腫瘤細胞達到一定密度后向三維空間發(fā)展,，使細胞發(fā)生堆積(piled up),。
 
由于細胞不斷增殖分裂，細胞數(shù)量持續(xù)增多,，培養(yǎng)液的營養(yǎng)成分減少,，代謝產(chǎn)物增多，細胞受營養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響,，則發(fā)生密度抑制(Density inhibition),導致細胞分裂停止,。
 
3.停滯期(stagnate phase)
 
細胞量和密度達到飽和，細胞停滯增殖,。表明細胞進入到停滯期,細胞數(shù)量持平,，也稱為平頂期(plateau）。
 
特點：細胞不增殖,有代謝活動,。培養(yǎng)液中的營養(yǎng)已逐漸耗盡,代謝產(chǎn)物積累增多,pH降低,，此時需要傳代,否則細胞將會中毒,發(fā)生形態(tài)改變,細胞會從底物脫落死亡。
 
注意：
 
傳代過晚將影響下一代細胞的生長,至少要再傳 1～2代 ,通過換液淘汰死細胞和受損較輕的細胞,。待細胞全部恢復后再用,。
 
在這一點上要特別注意。