摘要：本文詳細(xì)闡述了周期型馬來絲蟲多基因克隆構(gòu)建載體及轉(zhuǎn)染細(xì)胞的研究,，通過RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增目標(biāo)基因,，構(gòu)建原核及真核表達(dá)載體,，并轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)分析。研究成功構(gòu)建了多基因轉(zhuǎn)化體系,，為絲蟲病疫苗及抗蟲藥物的研發(fā)提供了基礎(chǔ),。

引言

馬來絲蟲（Brugia malayi）是一種寄生在人體淋巴系統(tǒng)中的絲蟲，可引起馬來絲蟲病,。根據(jù)其微絲蚴出現(xiàn)于外周血液的時(shí)間,，馬來絲蟲可分為夜現(xiàn)周期型和亞周期型。周期型馬來絲蟲成蟲寄生于人體四肢淺部淋巴系統(tǒng),，特別是下肢,，導(dǎo)致急性淋巴結(jié)炎、淋巴管炎及象皮腫等癥狀,。馬來絲蟲病的防治主要依賴于藥物治療,，然而，藥物的副作用及抗藥性的出現(xiàn)使得疫苗研發(fā)變得尤為重要,。

熱休克蛋白70（HSP70）作為一種重要的免疫原,，在多種寄生蟲中均有表達(dá)，并顯示出良好的免疫保護(hù)效果,。此外,，馬來絲蟲M29編碼基因也被認(rèn)為是一種潛在的疫苗候選分子。因此,，克隆和表達(dá)這些基因,，構(gòu)建其轉(zhuǎn)化體系，對(duì)于開發(fā)抗絲蟲感染疫苗及藥物具有重要意義,。

本研究旨在克隆周期型馬來絲蟲HSP70基因及M29編碼基因,，構(gòu)建原核及真核表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)分析,，從而為絲蟲病疫苗及抗蟲藥物的研發(fā)提供基礎(chǔ),。通過多基因克隆及載體構(gòu)建，我們期望能夠篩選出高效表達(dá)的基因,，進(jìn)一步推進(jìn)絲蟲病防治策略的發(fā)展,。

材料與方法

1. 實(shí)驗(yàn)材料

• 蟲體材料：周期型馬來絲蟲成蟲，由南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院寄生蟲學(xué)教研室提供,。

• 細(xì)胞系：HeLa細(xì)胞,，購自ATCC細(xì)胞庫。

• 載體：原核表達(dá)載體pGEX-4T-3,，真核表達(dá)載體pcDNA3.1（+）,，由實(shí)驗(yàn)室保存。

• 試劑：某試劑RNA提取試劑盒,、某試劑反轉(zhuǎn)錄試劑盒,、某試劑PCR擴(kuò)增試劑盒,、某試劑DNA凝膠回收試劑盒、某試劑T4 DNA連接酶,、某試劑質(zhì)粒提取試劑盒,、某試劑限制性內(nèi)切酶、某試劑IPTG誘導(dǎo)劑,、某試劑細(xì)胞培養(yǎng)基,、某試劑轉(zhuǎn)染試劑。

• 儀器：某品牌臺(tái)式高速離心機(jī),、某品牌紫外可見分光光度計(jì),、某品牌高壓滅菌器、某品牌凝膠成像系統(tǒng),、某品牌PCR儀,、某品牌水平電泳槽、某品牌電泳儀,、某品牌恒溫培養(yǎng)箱,、某品牌電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、某品牌恒溫水浴箱,、某品牌旋渦振蕩器,、某品牌超凈工作臺(tái)、威尼德電穿孔儀,。

2. 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

• 從周期型馬來絲蟲成蟲中提取總RNA，使用某試劑RNA提取試劑盒按照說明書操作,。

• 將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,，使用某試劑反轉(zhuǎn)錄試劑盒，按照說明書操作,。

2.2 基因克隆及載體構(gòu)建

• 根據(jù)GenBank上公布的周期型馬來絲蟲HSP70基因（登錄號(hào)：M68933）及M29編碼基因的序列,，設(shè)計(jì)引物。

• 使用某試劑PCR擴(kuò)增試劑盒,，以cDNA為模板擴(kuò)增目的基因,。

• PCR產(chǎn)物經(jīng)某品牌凝膠成像系統(tǒng)檢測后，使用某試劑DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段,。

• 將目的片段與原核表達(dá)載體pGEX-4T-3及真核表達(dá)載體pcDNA3.1（+）分別進(jìn)行雙酶切,，使用某試劑限制性內(nèi)切酶,，按照說明書操作。

• 使用某試劑T4 DNA連接酶將目的片段與載體連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒,。

• 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，涂布于含抗生素的LB平板上，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。

• 挑取單克隆菌落,，使用某試劑質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，并進(jìn)行雙酶切鑒定及測序驗(yàn)證,。

2.3 重組蛋白表達(dá)及鑒定

• 將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）中,，涂布于含抗生素的LB平板上，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜,。

• 挑取單克隆菌落,，接種于含抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.6-0.8,。

• 加入IPTG誘導(dǎo)劑,，37℃恒溫?fù)u床繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。

• 收集菌體,，使用SDS-PAGE進(jìn)行蛋白表達(dá)分析,，使用某品牌凝膠成像系統(tǒng)檢測目的蛋白的表達(dá)情況。

2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及表達(dá)分析

• 將HeLa細(xì)胞接種于6孔板中,，培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)到70%-80%,。

• 使用某試劑轉(zhuǎn)染試劑，按照說明書操作,，將構(gòu)建成功的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至HeLa細(xì)胞中,。

• 轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，收集細(xì)胞,，使用SDS-PAGE進(jìn)行蛋白表達(dá)分析,，使用某品牌凝膠成像系統(tǒng)檢測目的蛋白的表達(dá)情況。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1. 基因克隆及載體構(gòu)建

成功克隆了周期型馬來絲蟲HSP70基因及M29編碼基因,，并構(gòu)建了原核表達(dá)載體pGEX-4T-3-HSP70,、pGEX-4T-3-M29及真核表達(dá)載體pcDNA3.1（+）-HSP70、pcDNA3.1（+）-M29,。雙酶切鑒定及測序驗(yàn)證結(jié)果表明,，構(gòu)建的重組質(zhì)粒符合預(yù)期大小，且序列正確,。

2. 重組蛋白表達(dá)及鑒定

在大腸桿菌BL21（DE3）中成功表達(dá)了重組蛋白GST-HSP70及GST-M29,，SDS-PAGE分析結(jié)果顯示，誘導(dǎo)組出現(xiàn)特異性蛋白表達(dá)條帶,，與預(yù)計(jì)大小相符,。目的蛋白占菌體總蛋白的10%-15%。

3. 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及表達(dá)分析

成功將真核表達(dá)載體pcDNA3.1（+）-HSP70及pcDNA3.1（+）-M29轉(zhuǎn)染至HeLa細(xì)胞中,，SDS-PAGE分析結(jié)果顯示,，轉(zhuǎn)染組出現(xiàn)特異性蛋白表達(dá)條帶，與預(yù)計(jì)大小相符。目的蛋白在HeLa細(xì)胞中成功表達(dá),。

討論

本研究成功構(gòu)建了周期型馬來絲蟲HSP70基因及M29編碼基因的原核及真核表達(dá)載體,，并實(shí)現(xiàn)了在大腸桿菌及HeLa細(xì)胞中的高效表達(dá)。這一研究為絲蟲病疫苗及抗蟲藥物的研發(fā)提供了基礎(chǔ),。

1. 基因克隆及載體構(gòu)建策略

在基因克隆及載體構(gòu)建過程中,，我們選擇了常用的EcoRⅠ和NotⅠ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，以確保目的片段與載體的正確連接,。同時(shí),，通過測序驗(yàn)證確保了構(gòu)建的重組質(zhì)粒序列正確，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了可靠的基礎(chǔ),。

2. 重組蛋白表達(dá)及鑒定

在大腸桿菌中表達(dá)重組蛋白時(shí),，我們選擇了IPTG誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并通過SDS-PAGE分析鑒定了目的蛋白的表達(dá)情況,。結(jié)果表明,，構(gòu)建的重組質(zhì)粒能夠在大腸桿菌中穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白，且表達(dá)量較高,。這一結(jié)果為后續(xù)純化及功能研究提供了基礎(chǔ),。

3. 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及表達(dá)分析

在細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中，我們選擇了常用的某試劑轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染,，并通過SDS-PAGE分析鑒定了目的蛋白在HeLa細(xì)胞中的表達(dá)情況,。結(jié)果表明，構(gòu)建的真核表達(dá)載體能夠成功轉(zhuǎn)染至HeLa細(xì)胞中,，并表達(dá)目的蛋白,。這一結(jié)果為后續(xù)免疫學(xué)研究及疫苗研發(fā)提供了基礎(chǔ)。

4. 研究的創(chuàng)新與應(yīng)用前景

本研究的創(chuàng)新之處在于成功構(gòu)建了周期型馬來絲蟲多基因克隆轉(zhuǎn)化體系,，并實(shí)現(xiàn)了在大腸桿菌及HeLa細(xì)胞中的高效表達(dá),。這一研究為絲蟲病疫苗及抗蟲藥物的研發(fā)提供了新的思路和方法。未來,，我們將進(jìn)一步開展免疫學(xué)研究，評(píng)估目的蛋白的免疫保護(hù)效果,，為絲蟲病防治策略的發(fā)展提供科學(xué)依據(jù),。