摘要：

本文研究了通過(guò)電穿孔法使用線性多核苷酸增強(qiáng)真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染的效率和效果,。實(shí)驗(yàn)采用威尼德電穿孔儀,，利用優(yōu)化后的電穿孔參數(shù)，成功在人類(lèi)造血細(xì)胞,，特別是樹(shù)突細(xì)胞（DC）中實(shí)現(xiàn)高效基因遞送,。該方法優(yōu)于傳統(tǒng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染和質(zhì)粒cDNA電穿孔，為基因治療,、疫苗開(kāi)發(fā)和免疫治療提供了有力工具,。

引言：

基因遞送是基因治療、疫苗開(kāi)發(fā)和免疫治療中的關(guān)鍵環(huán)節(jié),。傳統(tǒng)方法如脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染和質(zhì)粒cDNA電穿孔雖已廣泛應(yīng)用,，但存在轉(zhuǎn)染效率低、細(xì)胞毒性大等問(wèn)題,。線性多核苷酸作為基因遞送的載體,，具有穩(wěn)定性高、易于合成和修飾等優(yōu)點(diǎn),。然而,，如何高效地將線性多核苷酸遞送到真核細(xì)胞中，仍是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn),。

電穿孔法作為一種物理轉(zhuǎn)染方法,，通過(guò)施加短暫的高壓電脈沖，在細(xì)胞膜上形成瞬時(shí)微孔,，使帶電荷的分子如DNA,、RNA等能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。與其他轉(zhuǎn)染方法相比,，電穿孔法具有操作簡(jiǎn)便,、適用范圍廣、轉(zhuǎn)染效率高等優(yōu)點(diǎn),。本研究旨在通過(guò)優(yōu)化電穿孔參數(shù)，使用線性多核苷酸作為載體，增強(qiáng)真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率和效果,，為基因治療、疫苗開(kāi)發(fā)和免疫治療提供新的策略和方法,。

材料與方法：

1. 實(shí)驗(yàn)材料：

• 細(xì)胞：人類(lèi)外周血單核細(xì)胞（PBMC）、單核細(xì)胞衍生的樹(shù)突細(xì)胞（Mo-DC）,。

• 線性多核苷酸：增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）mRNA,。

• 試劑：某試劑IMDM培養(yǎng)基、Opti-MEM培養(yǎng)基,、Optimix培養(yǎng)基,、電穿孔緩沖液,、成熟刺激劑（IL-1β,、IL-6、TNF-α,、PGE2等）,。

• 儀器：威尼德電穿孔儀、流式細(xì)胞儀（FACS）,。

2. 實(shí)驗(yàn)方法：

• 細(xì)胞培養(yǎng)與分化：從新鮮血液中分離PBMC,，用IMDM培養(yǎng)基洗滌后，用電穿孔洗滌緩沖液洗滌,，并以一定密度重新懸浮在Opti-MEM或Optimix培養(yǎng)基中,。對(duì)于Mo-DC的分化，將PBMC在補(bǔ)充了GM-CSF和IL-4的培養(yǎng)基中培養(yǎng)6-7天,。

• 電穿孔轉(zhuǎn)染：在電穿孔前,，將EGFP mRNA添加到細(xì)胞中，混合均勻后,，將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到威尼德電穿孔儀的樣品池中,。設(shè)置合適的電穿孔參數(shù)（如電壓、脈沖時(shí)間,、電容等），觸發(fā)電穿孔,。

• 細(xì)胞成熟與檢測(cè)：對(duì)于Mo-DC,，在電穿孔后，通過(guò)添加成熟刺激劑誘導(dǎo)其成熟。在轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn),，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)EGFP的表達(dá)水平和細(xì)胞存活率,。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1. 轉(zhuǎn)染效率：

   實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過(guò)優(yōu)化電穿孔參數(shù),，本研究成功在人類(lèi)造血細(xì)胞,，特別是Mo-DC中實(shí)現(xiàn)了高效基因遞送。在不成熟的Mo-DC中,，使用400V的電壓和500μs的脈沖時(shí)間,，轉(zhuǎn)染效率可達(dá)4%以上。進(jìn)一步提高電壓至600V,，轉(zhuǎn)染效率有所增強(qiáng),，但細(xì)胞存活率略有下降。

2. 細(xì)胞存活率：

   電穿孔后,，細(xì)胞存活率受到一定影響,。然而，通過(guò)優(yōu)化電穿孔參數(shù)和細(xì)胞培養(yǎng)條件,，本研究成功地將細(xì)胞死亡率控制在較低水平,。在電穿孔后96小時(shí)，即使使用600V的電壓,，死亡細(xì)胞數(shù)量也僅為大約16%,。

3. 基因表達(dá)與細(xì)胞成熟：

   在轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)EGFP的表達(dá)水平,。結(jié)果表明,，EGFP在Mo-DC中成功表達(dá)，且表達(dá)水平隨時(shí)間逐漸增加,。同時(shí),，通過(guò)添加成熟刺激劑，成功誘導(dǎo)了Mo-DC的成熟,。成熟后的Mo-DC具有更強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)能力和更低的細(xì)胞死亡率,。

4. 冷凍保存與復(fù)蘇：

   實(shí)驗(yàn)還探索了轉(zhuǎn)染后的Mo-DC的冷凍保存與復(fù)蘇效果。結(jié)果表明,，在電穿孔后18小時(shí)冷凍的不成熟的Mo-DC在解凍后能夠很好地存活并表達(dá)EGFP,。然而，在解凍后24小時(shí),，與在電穿孔后已培養(yǎng)了48小時(shí)的未冷凍對(duì)照相比,，冷凍培養(yǎng)物具有高水平的細(xì)胞死亡率。相比之下,，成熟的Mo-DC比冷凍的不成熟Mo-DC更好地從解凍過(guò)程中存活下來(lái),。

討論：

1. 電穿孔參數(shù)優(yōu)化：

   電穿孔參數(shù)是影響轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞存活率的關(guān)鍵因素,。本研究通過(guò)優(yōu)化電壓、脈沖時(shí)間,、電容等參數(shù),，成功在人類(lèi)造血細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了高效基因遞送。結(jié)果表明,，適當(dāng)?shù)碾妷汉兔}沖時(shí)間可以顯著提高轉(zhuǎn)染效率,，但過(guò)高的電壓會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡率增加。因此,，在實(shí)際應(yīng)用中需要根據(jù)細(xì)胞類(lèi)型和實(shí)驗(yàn)需求選擇合適的電穿孔參數(shù),。

2. 細(xì)胞類(lèi)型與分化狀態(tài)：

   不同細(xì)胞類(lèi)型和分化狀態(tài)對(duì)電穿孔轉(zhuǎn)染的效率和效果具有顯著影響。本研究發(fā)現(xiàn),，在人類(lèi)造血細(xì)胞中,，Mo-DC具有較高的轉(zhuǎn)染效率和較低的細(xì)胞死亡率。此外,，不成熟的Mo-DC在轉(zhuǎn)染后更容易誘導(dǎo)成熟,，而成熟的Mo-DC則具有更強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)能力和更低的細(xì)胞死亡率。這些結(jié)果為后續(xù)研究和應(yīng)用提供了重要參考,。

3. 基因治療與免疫治療：

   本研究為基因治療,、疫苗開(kāi)發(fā)和免疫治療提供了新的策略和方法。通過(guò)電穿孔法將線性多核苷酸遞送到真核細(xì)胞中,，可以實(shí)現(xiàn)高效基因表達(dá)和功能調(diào)控,。這對(duì)于治療遺傳性疾病、感染性疾病和癌癥等具有重要意義。同時(shí)，該方法還可以用于制備基于DC的腫瘤疫苗和免疫治療試劑,，為癌癥治療提供新的途徑和手段,。

4. 創(chuàng)新與應(yīng)用前景：

   本研究在電穿孔轉(zhuǎn)染技術(shù)方面取得了重要?jiǎng)?chuàng)新,。通過(guò)優(yōu)化電穿孔參數(shù)和使用線性多核苷酸作為載體，成功實(shí)現(xiàn)了高效基因遞送和細(xì)胞功能調(diào)控。該技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、適用范圍廣,、轉(zhuǎn)染效率高等優(yōu)點(diǎn)，在基因治療,、疫苗開(kāi)發(fā)和免疫治療等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景,。