摘要

本研究旨在探討外源性端粒酶基因（hTERT）轉(zhuǎn)染對豬氣管上皮細(xì)胞（STECs）增殖特性的影響,。通過脂質(zhì)體法將重組質(zhì)粒pCI-neo-hTERT導(dǎo)入STECs，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞表現(xiàn)出增高的增殖活性,，并保持基本的細(xì)胞生物學(xué)特征,，為建立穩(wěn)定傳代的細(xì)胞系提供了可能,。

引言

哺乳動物的氣管黏膜上皮細(xì)胞（Trachea epithelium cells, TECs）不僅是多種病原體的靶細(xì)胞，也是阻擋病原入侵的重要屏障,。豬氣管上皮細(xì)胞（Swine trachea epithelium cells, STECs）作為研究豬呼吸道疾病發(fā)病機(jī)制的重要模型,，其體外培養(yǎng)技術(shù)的建立具有重要意義。然而,，原代培養(yǎng)的STECs存在壽命短暫的局限性,，限制了其廣泛應(yīng)用。端粒酶是一種能夠維持端粒長度的核糖核蛋白復(fù)合物,，通過激活端粒酶,，可以延長細(xì)胞在體外培養(yǎng)的壽命，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的永生化,。本研究通過轉(zhuǎn)染外源性端粒酶基因（hTERT）至STECs,，探討其對細(xì)胞增殖特性的影響,，旨在為建立永生化的豬氣管上皮細(xì)胞系奠定基礎(chǔ),。

材料與方法

材料

• 細(xì)胞：初生仔豬氣管黏膜上皮細(xì)胞（STECs）

• 質(zhì)粒：重組質(zhì)粒pCI-neo-hTERT

• 試劑：某品牌鏈酶蛋白酶、某品牌脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑,、某品牌G418抗生素,、某品牌RNA提取試劑、某品牌PCR擴(kuò)增試劑,、某品牌Western blot試劑

• 儀器：倒置顯微鏡,、某品牌PCR儀、某品牌電泳儀,、某品牌Western blot成像系統(tǒng),、威尼德電穿孔儀

方法

1. STECs的分離與培養(yǎng)：無菌采取初生仔豬氣管，采用鏈酶蛋白酶灌注冷消化法分離得到原代STECs,。分離后的細(xì)胞在37℃,、5% CO2條件下培養(yǎng)，并觀察細(xì)胞形態(tài),。

2. 細(xì)胞鑒定：采用間接免疫熒光法鑒定8型角蛋白的上皮源性,，確認(rèn)分離得到的細(xì)胞為豬氣管上皮細(xì)胞。

3. 基因轉(zhuǎn)染：以脂質(zhì)體法將重組質(zhì)粒pCI-neo-hTERT導(dǎo)入STECs,。脂質(zhì)體與質(zhì)粒的體積比為1:3,，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后加G418進(jìn)行抗性篩選1個(gè)月，得到抗G418的陽性克隆,，繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng),。

4. 基因表達(dá)檢測：采用PCR和Western blot法檢測轉(zhuǎn)染后STECs中hTERT基因的表達(dá)情況。

5. 細(xì)胞增殖活性檢測：用MTT法和流式細(xì)胞儀分別檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞的活力和增殖周期,。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

轉(zhuǎn)染效率與基因表達(dá)

通過倒置顯微鏡觀察,，轉(zhuǎn)染后的STECs形態(tài)正常,，細(xì)胞呈單層貼壁，多邊形鋪路石狀生長,。PCR擴(kuò)增得到大小為461 bp的hTERT基因片段,，Western blot檢測得到大小為125 ku的特異性條帶，表明hTERT基因在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中成功表達(dá),。

細(xì)胞增殖特性

細(xì)胞活力曲線顯示,，轉(zhuǎn)染后的STECs在接種后的第3～5天增殖速度最快。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示,，轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞核型為2倍體,，S期細(xì)胞比例達(dá)到48.35%，說明轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞具有較高的增殖活性,。

永生化細(xì)胞系的建立

經(jīng)過長期培養(yǎng),，轉(zhuǎn)染hTERT基因的STECs成功建立了永生化的細(xì)胞系，可傳代至55代以上,，且保持了原代細(xì)胞的形態(tài)及功能特性,。永生化細(xì)胞系具有正常的細(xì)胞增殖周期，比原代細(xì)胞生長更為活躍,。

討論

端粒酶與細(xì)胞永生化

端粒是影響細(xì)胞永生化機(jī)制的重要因素之一,。端粒長度決定了細(xì)胞的增殖能力和壽命，足夠長的端粒長度能在染色體末端形成環(huán)狀結(jié)構(gòu),，提供保護(hù),。當(dāng)端粒縮短到一定程度時(shí),，細(xì)胞將逐漸失去增殖能力,，導(dǎo)致衰老和死亡。通過激活端粒酶,，可以延長染色體末端DNA,，確保端粒足夠的長度，從而延長細(xì)胞在體外培養(yǎng)的壽命,。本研究通過轉(zhuǎn)染hTERT基因,，成功激活了STECs的端粒酶活性，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞的永生化,。

永生化細(xì)胞系的應(yīng)用前景

永生化細(xì)胞系具有長期培養(yǎng),、增殖活性高、遺傳性狀穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn),，是研究疾病發(fā)病機(jī)制,、藥物篩選和疫苗開發(fā)的重要工具。本研究建立的永生化的STECs不僅保持了原代細(xì)胞的形態(tài)及功能特性,，還具有更高的端粒酶活性和增殖活性,。該細(xì)胞系可用于豬呼吸道病原體的感染研究,，為揭示豬呼吸道疾病的發(fā)病機(jī)制提供新的細(xì)胞模型。

實(shí)驗(yàn)策略與創(chuàng)新點(diǎn)

本研究采用脂質(zhì)體法將重組質(zhì)粒pCI-neo-hTERT導(dǎo)入STECs,，通過優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件,，提高了轉(zhuǎn)染效率。同時(shí),，通過嚴(yán)格的抗性篩選和純化步驟,，成功建立了永生化的細(xì)胞系。該細(xì)胞系的建立不僅為豬呼吸道疾病的研究提供了新的細(xì)胞模型,，也為其他動物細(xì)胞永生化的研究提供了借鑒,。

研究的創(chuàng)新與應(yīng)用

創(chuàng)新點(diǎn)

1. 方法創(chuàng)新：本研究采用脂質(zhì)體法將hTERT基因轉(zhuǎn)染至STECs，成功實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞的永生化,，為豬呼吸道上皮細(xì)胞的長期培養(yǎng)提供了新方法,。

2. 模型創(chuàng)新：建立的永生化的STECs保持了原代細(xì)胞的形態(tài)及功能特性，具有更高的增殖活性,，為豬呼吸道病原體的感染研究提供了新的細(xì)胞模型,。

應(yīng)用前景

1. 疾病研究：永生化的STECs可用于豬呼吸道病原體的感染研究，揭示病原體的致病機(jī)制和宿主的防御機(jī)制,。

2. 藥物篩選：該細(xì)胞系可用于藥物篩選,，評估藥物對豬呼吸道病原體的抑制作用和細(xì)胞毒性,。

3. 疫苗開發(fā)：永生化的STECs可作為疫苗開發(fā)的細(xì)胞基質(zhì),，用于生產(chǎn)高效、安全的疫苗,。