摘要：本研究旨在通過基因打靶技術(shù),，構(gòu)建牛朊蛋白基因prnp的敲除載體,，并轉(zhuǎn)染牛胎兒成纖維細(xì)胞,，實(shí)現(xiàn)prnp基因的高效敲除。利用正負(fù)篩選策略富集中靶細(xì)胞,，最終獲得了9個(gè)陽性細(xì)胞克隆,。本研究為生產(chǎn)抗瘋牛病的轉(zhuǎn)基因牛提供了理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

引言：

朊蛋白（Prion protein）是動(dòng)物傳染性海綿狀腦病的致病蛋白,，由prnp基因編碼的一種糖蛋白,。在牛中，這種病癥被稱為瘋牛?。˙SE）,，是一種嚴(yán)重危害人類健康和世界經(jīng)濟(jì)發(fā)展的傳染性疾病。瘋牛病的病原體是PrPsc,，一種內(nèi)源性膜錨定蛋白PrPc（由prnp基因編碼）的異構(gòu)體,。PrPsc誘導(dǎo)PrPc向PrPsc的轉(zhuǎn)化是發(fā)病過程中的主要事件。因此,，科學(xué)家推斷PrPc缺失的動(dòng)物因缺乏轉(zhuǎn)化的底物而可能具有抵抗瘋牛病的能力,。

利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)對(duì)瘋牛病具有抵抗能力的“超級(jí)牛”成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn),?；虼虬屑夹g(shù)是實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的關(guān)鍵，它可以通過外源DNA與染色體DNA之間的同源重組,，定點(diǎn)修飾和改造基因DNA片段,。在哺乳動(dòng)物中，由于隨機(jī)重組的頻率遠(yuǎn)高于同源重組,，因此構(gòu)建高效的打靶載體并采用有效的篩選策略至關(guān)重要,。

本研究利用正負(fù)篩選策略（Positive-negative selection, PNS），結(jié)合Cre-Loxp重組系統(tǒng)的原理,，構(gòu)建了牛朊蛋白基因prnp的敲除載體,，并通過電穿孔法轉(zhuǎn)染牛胎兒成纖維細(xì)胞，旨在獲得prnp基因敲除的陽性細(xì)胞克隆,，為生產(chǎn)抗瘋牛病的轉(zhuǎn)基因牛提供供體細(xì)胞,。

材料與方法：

1. 材料與試劑：

   打靶載體PA2T、牛胎兒成纖維細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存,。EX Taq酶,、pMD20-T Vector、DNA連接試劑盒購自某品牌公司,，DNA凝膠回收試劑盒購自某品牌公司,，各種限制性內(nèi)切酶購自某品牌公司，無內(nèi)毒素質(zhì)粒大量提取試劑盒購自某品牌公司。細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑包括基本培養(yǎng)基（DMEM）,、胎牛血清,、胰蛋白酶、L-谷氨酰胺,、丙酮酸鈉,、非必需氨基酸、青霉素,、鏈霉素等,，均購自某品牌公司,。G418購自某品牌公司,，其他試劑購自某品牌公司等。

2. 基因組DNA的提取：

   無菌制備荷斯坦奶?？鼓?，使用某品牌公司的血液/細(xì)胞/組織基因組提取試劑盒提取基因組DNA。

3. prnp基因打靶載體PBONP的構(gòu)建：

   3.1 PCR擴(kuò)增及克隆3'同源臂和5'同源臂：

   設(shè)計(jì)上下游引物,，以牛全血基因組DNA為模板,，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。3'同源臂和5'同源臂的擴(kuò)增產(chǎn)物分別連接到pMD20-T Vector載體上,，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α,，抽提質(zhì)粒，經(jīng)酶切及測序鑒定,。

   3.2 3',、5'同源臂插入打靶載體PA2T：

   將測序正確的克隆的質(zhì)粒與打靶載體PA2T同時(shí)用限制性內(nèi)切酶雙酶切，回收同源臂和骨架載體片段,，通過T4 DNA連接酶連接,，轉(zhuǎn)化DH5α，提取質(zhì)粒,，酶切,、PCR鑒定。

4. 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染：

   牛胎兒成纖維細(xì)胞在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng),。使用威尼德電穿孔儀將打靶載體PBONP轉(zhuǎn)染牛胎兒成纖維細(xì)胞,。

5. 正負(fù)篩選：

   轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞分別用600μg/mL G418和200nmol/mL Ganciclovir（GCV）進(jìn)行正負(fù)藥物篩選，獲得藥物抗性細(xì)胞克隆,。

6. 細(xì)胞克隆的鑒定：

   采用PCR,、測序、間接免疫熒光試驗(yàn)及Western blotting試驗(yàn)對(duì)藥物抗性細(xì)胞克隆進(jìn)行鑒定,，確定陽性細(xì)胞克隆,。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1. prnp基因同源臂的擴(kuò)增與克隆：

   通過PCR技術(shù)成功地從牛的全血基因組中擴(kuò)增出prnp基因的兩個(gè)同源臂，長度分別為1727bp和3860bp。測序結(jié)果表明,，克隆出的同源短臂和同源長臂的序列與GeneBank上公布的基因序列一致,。

2. 打靶載體PBONP的構(gòu)建：

   以通用型打靶載體PA2T為基本骨架，將牛prnp基因的長短同源臂導(dǎo)入其中,，成功構(gòu)建了牛朊蛋白基因敲除載體PBONP,。

3. 藥物篩選：

   確立了G418和GCV的最小細(xì)胞致死濃度和維持濃度，G418的致死濃度和維持濃度分別為600μg/mL和300μg/mL,，GCV的最小致死濃度和維持濃度分別為200nmol/mL和100nmol/mL,。利用電穿孔法將打靶載體PBONP轉(zhuǎn)染牛胎兒成纖維細(xì)胞，經(jīng)過G418和GCV的正負(fù)篩選,，最后得到176個(gè)藥物抗性的細(xì)胞克隆,。

4. 細(xì)胞克隆的鑒定：

   通過PCR、間接免疫熒光和Western blotting試驗(yàn)的多次鑒定,，確定了176個(gè)藥物抗性細(xì)胞克隆中有9個(gè)是陽性細(xì)胞克隆,。這些陽性細(xì)胞克隆中的prnp基因被成功敲除。