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PCR反應(yīng)DNA 復(fù)制過程解讀

來源:上海撫生實業(yè)有限公司   2025年01月21日 10:36  

       PCR全稱多聚酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction),,是一種非常強大的技術(shù),,可以通過一種非常簡單但是高效的方法來復(fù)制DNA,它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制,,PCR的最大特點是能將微量的DNA大幅增加。
復(fù)制DNA必要性:
DNA復(fù)制是很多研究的基礎(chǔ),,例如,,當我們對RNA進行測序時,必須先將RNA轉(zhuǎn)化為DNA,,并進行大量復(fù)制,。在對于某個人進行基因組測序時,我們不能對于某個細胞或者單個分子進行測序,。測序的基礎(chǔ)要求擁有大量的相同的DNA分子拷貝,,因此,DNA復(fù)制是做生物研究中的基礎(chǔ)工具,。那么怎么獲取這么多拷貝呢,?PCR正是一個復(fù)印機一般的存在,利用DNA的幾個特性,,成為批量復(fù)制DNA的方法,。

PCR原理及步驟:
說到原理,我們就要回顧一下DNA結(jié)構(gòu):

DNA分子兩條單鏈以雙螺旋結(jié)構(gòu)結(jié)成,,DNA兩條鏈擁有自行粘附的特性,,A與T配對,,C與G配對,DNA粘附特性是PCR的核心原理,。同時DNA復(fù)制時也是具有方向性的,,DNA序列的開始端稱為5‘端,末端稱為3’端,。
在復(fù)制時,,需要加入一種叫做引物(primers)的東西??梢詫⒁锢斫鉃橐粋€短序列,,下圖中紅色的部分就是引物。引物通常15到20個堿基,,可以短一些,,也可以長一些。但是必須和我們想合成的DNA片段成互補關(guān)系,。將引物與DNA鏈混合時,,會自動粘在上面,因為他們是互補的,。引物獲得可以從公司訂購,,后續(xù)有機會我們也會分享引物設(shè)計方法。

PCR過程分三步:
變性--退火--延伸,,PCR中會對這三步循環(huán)播放,。
A. 變性

在開始準備變性的過程中,要慢慢加熱混合物,,加熱混合物時,,兩條鏈間氫鍵會融化,DNA兩股鏈會分開,,就像上圖粉色的部分,。如果混合物熱的情況下,引物不會和DNA黏在一起,,兩條DNA鏈也不會黏在一起,。
B. 退火
接下來混合物慢慢的冷卻,這時引物會黏在DNA上,,因為引物較小,,更容易漂浮起來,和DNA結(jié)合,。溫度控制在54攝氏度左右可以保證引物序列和DNA互補配對,,而DNA雙鏈不會黏在一起。
C. 延伸
這一步我們需要一個幫助DNA復(fù)制的工具,即聚合酶鏈式反應(yīng)中的聚合酶(polymerase),。下圖中綠色的圖形就代表著DNA聚合酶,,所到之處萬物生,這也是我們身體各個細胞中用來復(fù)制DNA的工具,。聚合酶的作用方式也非常生猛,,直接找到部分單鏈,部分雙鏈的地方,,咬住那里的序列開始進行復(fù)制,。也就是說聚合酶會先找到引物,,開始沿著引物進行缺失的序列填充,。如下圖中看到的,在一輪填充序列后,,引物所在的鏈條(橙色鏈)會被補齊,。這一步中會加入As, Cs, Gs和Ts這些DNA原材料,這樣可以把他們整合到新的與模板DNA 鏈互補的半保留復(fù)制鏈,。這一步的溫度稍微高一些,,大概是72攝氏度。最初我們加入的是雙鏈DNA,,在一個周期后,,我們會獲得四條鏈,兩個周期后獲得8條鏈,,30個周期后,,會獲得10億條DNA鏈。

DNA 復(fù)制所需的基本要素:
       DNA 的半保留復(fù)制是生物進化和傳代的重要途徑,。雙鏈 DNA 在多種酶的作用下可以變性解旋成單鏈,,在 DNA 聚合酶的參與下,根據(jù)堿基互補配對原則復(fù)制成同樣的兩分子拷貝,。在實驗中發(fā)現(xiàn),,DNA 在高溫時也可以發(fā)生變性解鏈,當溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈,。因此,,通過溫度變化控制 DNA 的變性和復(fù)性,加入設(shè)計引物,,DNA 聚合酶,,dNTP 就可以完成特定基因的體外復(fù)制,這是 PCR 的理論基礎(chǔ),。PCR 反應(yīng)是在體外模擬 DNA 的復(fù)制過程,,因此反應(yīng)體系中必須具有 DNA 復(fù)制所需的基本要素:
1、模板(template),含有需要擴增的 DNA 片段,。
2,、引物(primer),一對引物決定了需要擴增的起始和終止位置,。
3,、聚合酶(polymerase ),DNA 聚合酶復(fù)制需要擴增的區(qū)域,。
4,、脫氧核苷三磷酸(dNTP),用于構(gòu)造新的互補鏈,。
5,、緩沖液(buffer),提供適合聚合酶行使功能的化學(xué)環(huán)境,。


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