摘要

本文研究了基于定向改造的釀酒酵母丙酮酸積累,，通過基因敲除和發(fā)酵條件優(yōu)化，顯著提高了釀酒酵母中丙酮酸的積累量。實驗結果顯示,，優(yōu)化后的釀酒酵母菌株丙酮酸積累量提高了168%，為丙酮酸的工業(yè)化生產提供了新的策略。

引言

丙酮酸是生物細胞內糖酵解途徑（EMP）中的關鍵中間產物，不僅在生物能量代謝中具有重要作用,，而且是多種有用物質的前體，廣泛應用于化工,、農藥,、農用化學品及生物制藥等領域。目前,，丙酮酸的生產主要依賴于微生物發(fā)酵,，其中光滑球擬酵母（Torulopsis glabrata）是常用的生產菌株。然而,，光滑球擬酵母是一種條件致病菌,，存在潛在的安全威脅。相比之下,，釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作為一種的安全菌,，在食品工業(yè)和酒精生產中有著廣泛應用,，因此更適合作為丙酮酸的生產菌株,。

釀酒酵母中的丙酮酸主要通過糖酵解途徑生成，并隨后進入乙醇發(fā)酵途徑被轉化為乙醇和二氧化碳,。為了提高釀酒酵母中丙酮酸的積累量,，需要阻斷乙醇生成途徑，使代謝流更多地流向丙酮酸,。丙酮酸脫羧酶（PDC）是催化丙酮酸轉化為乙醛的關鍵酶,，通過敲除PDC基因,，可以阻斷乙醇生成途徑，從而提高丙酮酸的積累量,。

本研究旨在通過定向改造釀酒酵母,，敲除PDC基因，并通過發(fā)酵條件優(yōu)化,，提高丙酮酸的積累量,。這不僅有助于解決光滑球擬酵母的安全性問題，還能為丙酮酸的工業(yè)化生產提供新的策略,。

材料與方法

1. 實驗材料

• 菌株：釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae Y2

• 試劑：某試劑G418,、某試劑醋酸鋰、某試劑PCR試劑,、某試劑Southern blot試劑,、某試劑葡萄糖、某試劑蛋白胨,、某試劑酵母粉,、某試劑KH2PO4、某試劑MgSO4·7H2O,、某試劑醋酸鈉,、某試劑玉米漿

• 儀器：威尼德電穿孔轉化儀、某品牌PCR儀,、某品牌凝膠成像系統(tǒng),、某品牌搖床、某品牌發(fā)酵罐

2. 實驗方法

2.1 基因敲除

1. pdcl基因敲除：設計pdcl基因的敲除片段（P1K）,，通過電穿孔轉化法將敲除片段轉化到釀酒酵母S. cerevisiae Y2中,，在含G418抗性的YEPD平板上篩選轉化子。通過PCR和Southern blot驗證得到pdcl基因的敲除菌株S. cerevisiae Y2-1,。

2. pdc5基因敲除：設計pdc5基因的敲除片段（P5H）,，通過醋酸鋰轉化法將敲除片段轉化到S. cerevisiae Y2-1中，在YNBG平板上篩選轉化子,。通過PCR和Southern blot驗證得到pdcl和pdc5基因都缺失的菌株S. cerevisiae Y2-15,。

2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化

1. 種子培養(yǎng)基：葡萄糖30g/L，蛋白胨10g/L,，酵母粉5g/L,，KH2PO4 1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L,，醋酸鈉2g/L,，玉米漿0.5%，pH 5.6,。

2. 發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖80g/L,，蛋白胨20g/L,，酵母粉10g/L，醋酸鈉2.5g/L,，玉米漿1%,，KH2PO4 1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L,，金屬離子母液5mL,，pH 5.6。

3. 發(fā)酵條件：種齡26h,，接種量12%,，裝液量70mL/250mL三角瓶。

2.3 丙酮酸測定

采用高效液相色譜法測定發(fā)酵液中丙酮酸的濃度,。

實驗結果

1. 基因敲除結果

通過PCR和Southern blot驗證,，成功得到了pdcl基因敲除菌株S. cerevisiae Y2-1和pdcl、pdc5基因都缺失的菌株S. cerevisiae Y2-15,。

2. 發(fā)酵條件優(yōu)化結果

優(yōu)化后的發(fā)酵條件下,，S. cerevisiae Y2-15的丙酮酸積累量顯著提高。與優(yōu)化前相比,，丙酮酸的積累量從9.25g/L提高到24.85g/L,，提高了168%。

討論

1. 基因敲除對丙酮酸積累的影響

PDC基因是釀酒酵母中催化丙酮酸轉化為乙醛的關鍵酶基因,。通過敲除PDC基因,，阻斷了乙醇生成途徑，使代謝流更多地流向丙酮酸,。本研究中,，首先敲除了pdcl基因，得到S. cerevisiae Y2-1菌株,，在此基礎上進一步敲除了pdc5基因,，得到S. cerevisiae Y2-15菌株。實驗結果顯示,，敲除兩個PDC基因后,，丙酮酸的積累量顯著提高，說明基因敲除策略是有效的,。

2. 發(fā)酵條件優(yōu)化對丙酮酸積累的影響

發(fā)酵條件對微生物代謝產物的積累具有重要影響,。本研究通過優(yōu)化種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件,，顯著提高了S. cerevisiae Y2-15菌株的丙酮酸積累量,。優(yōu)化后的種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基提供了適宜的營養(yǎng)物質比例和濃度,，有利于菌體的生長和代謝產物的積累,。優(yōu)化后的發(fā)酵條件,，如種齡、接種量和裝液量,，有利于氧氣的傳遞和菌體的代謝活動,，從而提高了丙酮酸的積累量。

3. 研究的創(chuàng)新與應用前景

本研究通過定向改造釀酒酵母,，敲除PDC基因,，并通過發(fā)酵條件優(yōu)化，顯著提高了丙酮酸的積累量,。這種策略不僅解決了光滑球擬酵母的安全性問題,，還為丙酮酸的工業(yè)化生產提供了新的思路。釀酒酵母作為一種的安全菌,，在食品工業(yè)和酒精生產中有著廣泛應用,，因此，改造后的釀酒酵母菌株具有廣闊的應用前景,。此外,，本研究中的基因敲除和發(fā)酵條件優(yōu)化策略也可以為其他微生物代謝產物的生產提供借鑒。

丙酮酸作為一種重要的有機酸,，在化工,、農藥、農用化學品及生物制藥等領域有著廣泛的應用,。隨著生物技術的不斷發(fā)展,，微生物發(fā)酵法生產丙酮酸將成為未來的主要趨勢。本研究通過定向改造釀酒酵母,，提高了丙酮酸的積累量,，為丙酮酸的工業(yè)化生產提供了新的策略，具有重要的理論和實踐意義,。

結論

本研究通過定向改造釀酒酵母,，敲除PDC基因，并通過發(fā)酵條件優(yōu)化,，顯著提高了丙酮酸的積累量,。實驗結果顯示，優(yōu)化后的釀酒酵母菌株丙酮酸積累量提高了168%,。這種策略不僅解決了光滑球擬酵母的安全性問題,，還為丙酮酸的工業(yè)化生產提供了新的思路。改造后的釀酒酵母菌株具有廣闊的應用前景,，為丙酮酸的生產和應用提供了新的策略,。本研究為其他微生物代謝產物的生產提供了借鑒，具有重要的理論和實踐意義,。

通過上述研究,，我們不僅提高了釀酒酵母中丙酮酸的積累量,，還為丙酮酸的工業(yè)化生產提供了新的策略。未來,，我們將繼續(xù)深入研究釀酒酵母的代謝調控機制,，進一步優(yōu)化發(fā)酵條件，提高丙酮酸的產量和質量,，為丙酮酸的應用提供更廣闊的空間,。