實驗原理：

試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。往預(yù)先包被植物半乳糖（Galactose）捕獲抗體的包被微孔中,，依次加入標本,、標準品,、HRP標記的檢測抗體,，經(jīng)過溫育并洗滌。用底物TMB顯色,，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的植物半乳糖（Galactose）呈正相關(guān),。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值）,，計算樣品濃度。

實驗所需自備試驗器材：

1. 酶標儀（450nm）

2. 高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL,、2-20uL,、20-200uL、200-1000uL

3. 37℃恒溫箱

4. 蒸餾水或去離子水

樣本處理及要求：

1. 血清：將收集于血清分離管的全血標本在室溫放置2小時或4℃過夜,，然后1000×g離心20 分鐘,，取上清即可，或?qū)⑸锨逯糜?/span>-20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。

2. 血漿：用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標本，并將標本在采集后的30分鐘內(nèi)于2-8℃ 1000×g離心15分鐘,，取上清即可檢測,，或?qū)⑸锨逯糜?/span>-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

3. 組織勻漿：用預(yù)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織,，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細胞會影響測量結(jié)果）,，稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應(yīng)體積的PBS（一般按1:9的重量體積比,，比如1g的組織樣品對應(yīng)9mL的PBS,，具體體積可根據(jù)實驗需要適當調(diào)整，并做好記錄,。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中,，于冰上充分研磨。為了進一步裂解組織細胞,，可以對勻漿液進行超聲破碎,，或反復(fù)凍融。最后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘,，取上清檢測,。

4. 細胞培養(yǎng)物上清：請1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測,，或?qū)⑸锨逯糜?/span>-20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

5. 其它生物標本：1000×g離心20分鐘,，取上清即可檢測,。

1. 樣品外觀：樣品應(yīng)清澈透明，懸浮物應(yīng)離心去除,。

2. 樣品保存：樣品收集后若在1周內(nèi)進行檢測的可保存于4℃,，若不能及時檢測，請按一次使用量分裝,，凍存于-20℃（1個月內(nèi)檢測）,，或-80℃（6個月內(nèi)檢測），避免反復(fù)凍融,，標本溶血會影響最后檢測結(jié)果,，因此溶血標本不宜進行此項檢測。

注意事項：

1. 嚴格按照規(guī)定的時間和溫度進行溫育以保證準確結(jié)果,。所有試劑都必須在使用前達到室溫20-25℃,。使用后立即冷藏保存試劑。

2. 洗板不正確可以導(dǎo)致不準確的結(jié)果,。在加入底物前確保盡量吸干孔內(nèi)液體,。溫育過程中不要讓微孔干燥掉。

3. 消除板底殘留的液體和手指印,，否則影響OD值,。

4. 底物顯色液應(yīng)呈無色或很淺的顏色,，已經(jīng)變藍的底物液不能使用。

5. 避免試劑和標本的交叉污染以免造成錯誤結(jié)果,。

6. 在儲存和溫育時避免強光直接照射,。

7. 平衡至室溫后再打開密封袋以防水滴凝聚在冷板條上。

8. 任何反應(yīng)試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發(fā)的強烈氣體,。任何漂白成分都會破壞試劑盒中反應(yīng)試劑的生物活性,。

9. 不能使用過期產(chǎn)品。

試劑盒性能：

1. 檢測范圍：10.0μg/mL –1000μg/mL,。

2. 靈敏度：最檢測濃度小于10.0μg/mL,。

3. 特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)。

4. 重復(fù)性：板內(nèi)變異系數(shù)小于10% ,，板間變異系數(shù)小于15% ,。

技術(shù)小提示：

1. 當混合或重溶蛋白溶液時，盡量避免起沫,。

2. 為了避免交叉感染,，配置不同濃度標準品、上樣,、加不同試劑都需要更換槍頭,。另外不同試劑請分別使用不同的移液槽。

3. 每次孵育時,，請正確使用封板膠可保證結(jié)果的準確性,。

4. 混合后的顯色底物在上板前應(yīng)為無色，請避光保存,；加入微孔板后,，將由無色變成不同深度的藍色,。

5. 終止液上板順序應(yīng)同顯色底物上板順序一致,；加入終止液后，孔內(nèi)顏色由藍變黃,；若孔內(nèi)有綠色,，則表明孔內(nèi)液體未混勻；請充分混合,。