引言

神經(jīng)干細胞（NSCs）具有自我更新能力和多向分化潛能,，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病基因治療的重要載體,。通過基因工程技術(shù)將外源基因?qū)隢SCs,，可以實現(xiàn)基因治療的目的,。增強型綠色熒光蛋白（EGFP）作為一種報告基因,，具有表達穩(wěn)定,、易于檢測的特點,，常被用于標記和追蹤細胞,。

脂質(zhì)體作為一種有效的基因轉(zhuǎn)染載體,，通過靜電相互作用將DNA分子導(dǎo)入細胞。脂質(zhì)體表面帶有正電荷,，可以與核酸磷酸基團的負電荷相互作用形成復(fù)合物,，進而被細胞膜吸附，通過內(nèi)吞或融合作用將外源DNA導(dǎo)入細胞,。脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染方法具有操作簡便,、轉(zhuǎn)染效率高的優(yōu)點，適用于多種細胞類型,。

構(gòu)建脂質(zhì)體介導(dǎo)的EGFP轉(zhuǎn)染NSCs體系,，不僅可以評估NSCs作為基因治療載體的潛力，還可以為轉(zhuǎn)染其他功能基因奠定基礎(chǔ),。通過優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件,，提高轉(zhuǎn)染效率，可以進一步推動NSCs在基因治療領(lǐng)域的應(yīng)用,。

材料與方法

1. 實驗材料

• 細胞：胎鼠,、新生大鼠、成年大鼠海馬中分離的NSCs,。

• 試劑：某品牌無血清DMEM/F12培養(yǎng)液,、某品牌添加劑B27、某品牌堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）,、某品牌表皮細胞生長因子（EGF）,、某品牌脂質(zhì)體試劑（TransFast）、某品牌G418,、某品牌pIRES2-EGFP質(zhì)粒,。

• 儀器：某品牌微量移液器,、某品牌熒光顯微鏡、某品牌倒置顯微鏡,、某品牌臺式離心機,、某品牌恒溫水浴箱、某品牌渦旋振蕩器,、某品牌血球計數(shù)板,。

2. 實驗方法

2.1 NSCs的分離與培養(yǎng)

（1）從胎鼠、新生大鼠,、成年大鼠海馬中分離NSCs,，采用NSC克隆懸浮法。
（2）選用無血清DMEM/F12培養(yǎng)液,，添加B27,、bFGF及EGF進行體外擴增培養(yǎng)。
（3）采用免疫細胞化學(xué)法檢測NSC標志物Nestin的表達及分化后細胞神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）,、膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）和2,3-環(huán)核甘酸磷酸二脂酶（CNP）的表達,。

2.2 胎鼠神經(jīng)干細胞離體后存活時間研究

（1）將胎鼠神經(jīng)干細胞進行原代培養(yǎng)，分為37℃組和4℃組,。
（2）37℃組在1/2,、1、2,、3,、4小時觀察細胞生長狀態(tài)；4℃組在1/2,、1,、2、3,、4天觀察細胞生長狀態(tài),。

2.3 脂質(zhì)體介導(dǎo)EGFP轉(zhuǎn)染NSCs

（1）將NSCs培養(yǎng)至適合轉(zhuǎn)染的狀態(tài)（細胞生長至70-90%的匯合度）。
（2）準備轉(zhuǎn)染試劑和質(zhì)粒DNA,，按照試劑說明書比例將轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)粒DNA混合在適當(dāng)?shù)木彌_液中,，輕輕混合并在室溫下孵育一定時間，讓轉(zhuǎn)染復(fù)合物形成,。
（3）將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入含細胞的培養(yǎng)皿或板中,，輕輕搖勻，使轉(zhuǎn)染復(fù)合物與細胞均勻接觸,。
（4）將細胞在培養(yǎng)箱中孵育4-6小時,，促進轉(zhuǎn)染復(fù)合物進入細胞。
（5）轉(zhuǎn)染后更換為新鮮的完整培養(yǎng)基,，減少轉(zhuǎn)染試劑對細胞的潛在毒性,。

2.4 轉(zhuǎn)染效率評估

（1）在轉(zhuǎn)染后24-48小時,，通過顯微鏡觀察細胞形態(tài)，評估轉(zhuǎn)染對細胞的影響,。
（2）使用熒光顯微鏡檢測報告基因（EGFP）的表達,，評估轉(zhuǎn)染效率。

2.5 移植與觀察

（1）將篩選后的NSCs立體定向儀移植入大鼠側(cè)腦室,。
（2）分別在移植后4周,、8周、12周,、15周進行大鼠腦組織冰凍切片制作,，熒光觀察。

結(jié)果

1. NSCs的培養(yǎng)與鑒定

培養(yǎng)的NSCs Nestin抗體標記陽性,，分化后細胞表達神經(jīng)元,、星型膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞的特異性抗原,。這表明分離培養(yǎng)的NSCs具有較高的純度，可以用于后續(xù)實驗,。

2. 胎鼠神經(jīng)干細胞離體后存活時間

在37℃組,，腦組織離體后1小時，已無法培養(yǎng)出干細胞,；在4℃組,，離體后3天，仍可以培養(yǎng)出NSCs,。這表明在低溫條件下,，NSCs的存活時間延長，有利于后續(xù)的實驗操作,。

3. 脂質(zhì)體介導(dǎo)EGFP轉(zhuǎn)染NSCs

（1）當(dāng)脂質(zhì)體劑量為8μl,，質(zhì)粒（pIRES2-EGFP）劑量為6μg，復(fù)合物作用時間為6小時,，3代時轉(zhuǎn)染效率高,，為27.6%。隨著傳代次數(shù)的增加,，轉(zhuǎn)染效率逐漸降低,。3代G2-M期所占的比例也最高，轉(zhuǎn)染率與G2-M期存在一定的關(guān)系,。
（2）G418最小致死濃度為5001μg/ml,。
（3）MTT比色法測定同期未轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染NSCs活性，兩組之間無顯著性差異（P>0.05）,，表明脂質(zhì)體介導(dǎo)的EGFP轉(zhuǎn)染對NSCs的活性無明顯影響,。

4. 移植與觀察

將篩選后的NSCs立體定向儀移植入大鼠側(cè)腦室后,，觀察綠色熒光的表達情況。隨著時間的推移,，綠色熒光逐漸朝針口周圍擴展,。在2周可見綠色熒光，強度較弱,；在4-8周熒光,，隨后逐漸減弱至12周時熒光基本消失，15周時觀察不到任何的熒光,。這表明EGFP在NSCs中能夠穩(wěn)定表達,，并可以用于細胞的追蹤和標記。

討論

1. 脂質(zhì)體介導(dǎo)EGFP轉(zhuǎn)染NSCs的優(yōu)化條件

實驗結(jié)果表明,，脂質(zhì)體劑量,、質(zhì)粒劑量、復(fù)合物作用時間以及細胞傳代次數(shù)對轉(zhuǎn)染效率有顯著影響,。通過優(yōu)化這些條件,，可以提高轉(zhuǎn)染效率。在本實驗中,，當(dāng)脂質(zhì)體劑量為8μl,，質(zhì)粒劑量為6μg，復(fù)合物作用時間為6小時,，3代時轉(zhuǎn)染效率高,。這些條件為后續(xù)的基因治療實驗提供了重要的參考。

2. EGFP作為報告基因的應(yīng)用

EGFP作為一種報告基因,，具有表達穩(wěn)定,、易于檢測的特點。在本實驗中,，通過熒光顯微鏡可以清晰地觀察到EGFP在NSCs中的表達情況,。這不僅可以用于評估轉(zhuǎn)染效率，還可以用于追蹤和標記移植后的細胞,。此外,，EGFP的表達還可以作為細胞活性的一個指標，為后續(xù)的細胞功能研究提供重要信息,。

3. NSCs作為基因治療載體的潛力

NSCs具有自我更新能力和多向分化潛能,，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病基因治療的重要載體。通過基因工程技術(shù)將外源基因?qū)隢SCs,，可以實現(xiàn)基因治療的目的,。本實驗成功地將EGFP導(dǎo)入NSCs，并觀察到其在體內(nèi)的穩(wěn)定表達。這為NSCs作為基因治療載體提供了實驗依據(jù),，也為后續(xù)的功能基因轉(zhuǎn)染奠定了基礎(chǔ),。

4. 研究的創(chuàng)新與應(yīng)用前景

本研究的創(chuàng)新之處在于成功構(gòu)建了脂質(zhì)體介導(dǎo)的EGFP轉(zhuǎn)染NSCs體系，并優(yōu)化了轉(zhuǎn)染條件,。通過這一體系,，可以實現(xiàn)高效、穩(wěn)定的基因轉(zhuǎn)染,，為NSCs在基因治療領(lǐng)域的應(yīng)用提供了新的思路和方法,。此外，本研究還為后續(xù)的功能基因轉(zhuǎn)染和疾病治療提供了重要的實驗依據(jù)和理論基礎(chǔ),。

在應(yīng)用前景方面,，脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)具有操作簡便、轉(zhuǎn)染效率高的優(yōu)點,，適用于多種細胞類型,。通過將治療基因?qū)隢SCs，可以實現(xiàn)疾病的基因治療,。此外,，EGFP作為報告基因，可以用于追蹤和標記移植后的細胞,，為疾病的診斷和治療提供新的手段,。

結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了脂質(zhì)體介導(dǎo)的EGFP轉(zhuǎn)染NSCs體系，并優(yōu)化了轉(zhuǎn)染條件,。實驗結(jié)果表明，脂質(zhì)體介導(dǎo)的EGFP轉(zhuǎn)染具有較高的轉(zhuǎn)染效率和長時間的表達,。這一體系為NSCs作為基因治療載體提供了實驗依據(jù),，也為后續(xù)的功能基因轉(zhuǎn)染奠定了基礎(chǔ)。通過進一步的研究和優(yōu)化,，脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)有望在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的基因治療中發(fā)揮重要作用,。