雙縮脲法蛋白質(zhì)含量測定試劑盒說明書

分光光度法 50T/48S

注意：正式測定之前選擇 2-3 個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定，確保蛋白濃度在 1～10mg/ml 范圍內(nèi)。

測定意義：

樣品可溶性蛋白質(zhì)含量常常用于酶活性計算,。此外,，可溶性蛋白質(zhì)含量也用于食品等質(zhì)量分析,。

測定原理：

強(qiáng)堿性溶液中,，雙縮脲與CuSO4 形成紫色絡(luò)合物,；紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比,，而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無關(guān),，故可用來測定蛋白質(zhì)含量。該方法測定范圍為 1~10mg 蛋白質(zhì),，適用于蛋白質(zhì)濃度高的樣品,，尤其是動物材料

自備儀器和用品：

可見分光光度計、臺式離心機(jī),、可調(diào)式移液器,、1 ml 玻璃比色皿、研缽,、冰和蒸餾水,。

組成：

標(biāo)準(zhǔn)品：液體 1ml×1 瓶，5 mg/ml,，4℃保存,。

樣品中可溶性蛋白質(zhì)提取：

1.        液體樣品：澄清無色液體樣品可以直接測定,。

2.        組織樣品：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織,，加入 1ml 提取液（自備，根據(jù)需要選用酶提取緩沖液或者蒸餾水或者生理鹽水）冰浴勻漿,，8000g,，4℃離心 10min，取上清,，即待測液,。（動物樣品常常需要稀釋）

3.        細(xì)菌,、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（104 個）：提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)胞加入1ml 提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w,，超聲 3 秒,，間隔 7 秒，總時間 3min）,；然后 8000g,，4℃，離心 10min,，取上清置于冰上待測,。

測定步驟：

1.     分光光度計預(yù)熱 30 min，調(diào)節(jié)波長到 540 nm,，蒸餾水調(diào)零,。

2.     空白管：取 1 mL 玻璃比色皿，加入 200μl 蒸餾水,，1000μl 試劑一,，混勻后室溫靜置 15 min，于 540nm 比色,，記為 A 空白管,。

3.     標(biāo)準(zhǔn)管：取 1 mL 玻璃比色皿，加入 200μl 標(biāo)準(zhǔn)液,，1000μl 試劑一,，混勻后室溫靜置 15 min，于 540 nm 比色,，記為 A 標(biāo)準(zhǔn)管,。

4.     測定管：取 1 mL 玻璃比色皿，加入 200μl 待測液,，1000μl 試劑一,，混勻后室溫靜置 15 min，于 540nm 比色,，記為 A 測定管,。

注意：空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需測定一次。

樣品中蛋白質(zhì)濃度計算公式

C 待測（mg/mL）= C 標(biāo)準(zhǔn)管×(A 測定管－A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管)

=5×(A 測定管－A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管)

注意事項：

1.  樣品蛋白濃度須在 1~10mg/ml 范圍內(nèi),，低于 1mg/ml 不能用此法,，高于 10mg/ml 須做相應(yīng)稀釋。因此測定前用 1~2 個樣做預(yù)實驗,，確保蛋白濃度在 1~10mg/ml 范圍內(nèi),。

2.  待測樣品蛋白提取可用生理鹽水、雙蒸水或不含蛋白的 PBS 提取。該法受硫酸銨,、Tris 緩沖液干擾，提取液中應(yīng)不含這些物質(zhì),；否則改用BCA 蛋白質(zhì)含量測定試劑盒,。