分子診斷是以 DNA、RNA 或蛋白質分子為診斷材料,,通過檢查人體內(nèi)源基因或外源(病原體)基因的存在、缺陷或表達異常,,對人體狀態(tài)或疾病作出特異性診斷的方法和過程,。分子診斷技術主要是聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction簡稱PCR)、原位雜交FISH,、基因芯片和基因測序技術,,與雜交、高通量測序技術相比,,PCR技術主要優(yōu)勢在于靈敏度更高,、特異性更強、操作簡單且易于推廣,,在檢測基因數(shù)量上有一定的局限性,,但從短期來看,PCR技術仍將是分子診斷的主流技術,。
翌圣生物在酶原料領域深耕多年,,長期為IVD企業(yè),、第三方檢驗機構,、科研機構等提供高品質、高性價比的分子診斷PCR原料,,包括逆轉錄酶,、RNase 抑制劑、Taq DNA 聚合酶,、尿嘧啶糖基化酶(UDG/UNG酶),、taq酶抗體、dNTPs等單組份以及經(jīng)過體系優(yōu)化的qPCR/RT-qPCR預混液,,可為臨床/非臨床診斷試劑盒開發(fā)提供性能優(yōu),、穩(wěn)定的酶原料。
分子診斷PCR擴增工作流程及原料一覽
一,、核心酶原料-Taq DNA聚合酶
隨著應用檢測領域的拓展和市場需求的提升,,野生型Taq DNA聚合酶已不能滿足需求,翌圣ZymeEditorTM酶改造平臺針對不同的應用需求,,定向改造了Taq DNA 聚合酶,,推出一系列適合全預混、耐抑制,、超潔凈等匹配不同應用方向的熱啟動Taq DNA 聚合酶,。
優(yōu)yue的穩(wěn)定性:配制成含引物探針的全預混液,,37℃ 7天處理后,低濃度檢出無變化
圖1:以HBV核酸為模板,,使用10726ES配制成qPCR全預混液,,除模板外所有體系在37℃下放置7天測試加速穩(wěn)定性。結果顯示:高,、中,、低濃度Ct值和熒光值無顯著變化,表明以10726ES配制的預混液性能穩(wěn)定,。
宿主gDNA殘留低:E. coli基因組DNA殘留<0.5 copies/ 100 U
圖2:E. coli基因組線性范圍:30 fg/μL-300 pg/μL,,相關性R2=0.9999。(B) 三批次Hieff UCF.ME® Sensitive Taq DNA Polymerase的E. coli基因組DNA殘留<0.5 copies/ 100 U,。
二,、核心酶原料-逆轉錄酶
作為RT-qPCR反應的關鍵原料之一,逆轉錄酶需要具備更快的逆轉錄速度,、更高的合成產(chǎn)量以及更好的耐熱性能,。為了獲得更適用于RT-qPCR的逆轉錄酶,翌圣生物在M-MLV的基礎上通過基因改造,,開發(fā)出RNaseH活性更低,,熱穩(wěn)定性更高,持續(xù)合成能力更強的Hifair®系列逆轉錄酶,。
可耐受58℃反應溫度,,適合復雜RNA模板的逆轉錄
圖3:將Hifair® V Reverse Transcriptase及進口品牌T*的逆轉錄酶分別在55℃及58℃下孵育30min檢測殘余酶活。結果顯示Hifair® V Reverse Transcriptase在58℃下孵育30min仍能保持70%活性,,遠超進口品牌,。
應用于RT-qPCR檢出率優(yōu)于其他品牌,檢出范圍:1 pg-1 μg
圖4:以1 pg-1 μg(7個梯度)的293T細胞總RNA為模板,,使用Hifair® V one-step RT-gDNA digestion SuperMix for qPCR(Cat#11142),、V*、T*進行逆轉錄,,得到的cDNA進行qPCR定量分析,。結果顯示,11142ES靈敏度可達1 pg,,檢出率優(yōu)于競品,。
三、其他酶及酶抑制劑:RNase抑制劑,、UDG酶
翌圣提供多種歷經(jīng)IVD工業(yè)應用驗證的酶,、RNase 酶抑制劑、Taq酶抗體等原料產(chǎn)品,,為廣泛的體外診斷產(chǎn)品的開發(fā)和生產(chǎn)提供豐富的高品質原料解決方案,,相關酶類等產(chǎn)品在保護分子檢測目標產(chǎn)物中廣泛應用,。
RNase 酶抑制劑:翌圣以可溶形式在大腸桿菌中表達純化的重組鼠源/豬源RNase抑制劑,能夠廣泛抑制各種類型RNase(RNase A, B, C),,并且該抑制劑不會抑制聚合酶的活性,,已驗證可廣泛應用于RT-PCR/qPCR、RNA-seq,、cDNA克隆和文庫構建等多個應用場景,。除了常規(guī)RNase抑制劑,還開發(fā)了經(jīng)過UCF.ME®超低殘留工藝處理,,宿主殘留更低,,適合對背景菌要求更為嚴格的應用場景的RNase抑制劑,助力解決病原檢測中的背景菌干擾,,提高檢測準確度,。
UDG酶:尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG酶),與dUTP搭配使用,,可建立PCR防污染體系,,翌圣研發(fā)的熱敏、低殘留UDG酶,,可避免常規(guī)UDG酶滅活后可能存在的殘留活性在常溫下對含dU擴增產(chǎn)物的降解作用,,同時防止分子酶中存在的背景菌造成PCR結果假陽性,對于準確鑒別感染病原體,,協(xié)助感染,、傳染病的臨床診斷至關重要。
Taq酶抗體:非特異性擴增是顯著影響PCR性能的主要問題之一,,熱啟動技術可以有效減少非特異擴增,??贵w修飾的熱啟動酶封閉效率高,,效果佳,室溫下穩(wěn)定,,酶活釋放速度快,,翌圣生物開發(fā)的熱啟動Taq酶雙封閉抗體不僅可以封閉Taq酶的5'→3'聚合酶活性,還能同時封閉Taq酶的5'→3'外切酶活性,,雙管齊下,,既能有效防止錯配或引物二聚體引起的非特異性擴增,又能防止探針或引物降解產(chǎn)生非特異信號,,雙重提升試劑的穩(wěn)定性,。
四、通用高性能全預混qPCR預混液
翌圣生物提供高品質qPCR試劑,,高性能的熱啟動Taq酶搭配優(yōu)化的緩沖體系,,可提供包括通用型預混液,,全預混預混液,基因分型預混液,,可凍干預混液等,,具有使用簡便、靈敏度高,、穩(wěn)定性強的特點,,加快您的分子診斷產(chǎn)品開發(fā)。
試劑通用性好:適配多類型多重引探(已驗證超40種不同類型靶標),,具有優(yōu)秀的擴增性能,;
強全預混穩(wěn)定性:37℃可放置14天,4℃可放置28天,,反復凍融50次性能穩(wěn)定,;
靈敏度高特異性好:靈敏度可檢測到0.25 copy/μL,特異性48孔陰性不起峰,;
支持快速程序:兼容快速程序,,30min即可出結果;
dUP/UDG防污染體系:引入了dUTP/UDG防污染系統(tǒng),,可有效防止氣溶膠污染,;
多平臺多體系適用: Bio-Rad CFX96、ABI Q5,、7500,、Slan、天隆等均適配,。
圖5:基于全預混試劑穩(wěn)定性考察,,實驗組與對照組試劑的Ct值偏差(△Ct值)在±0.5以內(nèi),熒光值偏差在15%以內(nèi),,翌圣全預混試劑具有優(yōu)秀的多重擴增穩(wěn)定性能,。
對16710ES分別進行三種方式處理(4℃、37℃以及凍融),。實驗組于4℃,、37℃分別處理7天,凍融50次,,與對照組(-20℃保存)在4組多重擴增體系(組1,、組2及組4為4重擴增體系,組3為3重擴增體系)下進行穩(wěn)定性測評,。
五,、通用高靈敏RT-qPCR預混液
一步法RT-qPCR試劑整合逆轉錄酶和熱啟動酶的優(yōu)性能,配合優(yōu)化的緩沖體系,可實現(xiàn)個位數(shù)拷貝模板的快速靈敏檢測,,經(jīng)過呼吸道疾病,、動物疫病、科研體系等各類客戶市場驗證,,可滿足各種應用方向的需求,。
通用性強:適用病原微生物、人源基因組,、植物等多物種的核酸進行qPCR擴增,、檢測;
優(yōu)異的擴增靈敏度:精心優(yōu)化的緩沖體系,,提高了低濃度模板的檢測靈敏度,,可高達250 copies/mL;
dUTP/UDG 防污染系統(tǒng):引入 dUTP/ Heat-labile UDG 防污染系統(tǒng),,高效降解產(chǎn)物的氣溶膠污染,,降低假陽性,確保結果真實可信,;
支持快速程序:兼容快速程序,,40 min內(nèi)完成結果檢測;
優(yōu)異的儲存穩(wěn)定性:37℃放置14天,、反復凍融10次試劑性能穩(wěn)定,。
圖6:使用翌圣RT-qPCR預混合(16630ES)和市面上同類產(chǎn)品Supplier-A,同時檢測4個病原靶標(副流感病毒HPIV2,、副流感病毒HPIV4,、呼吸道合胞病毒HRVA和鼻病毒RSVA),結果顯示16630ES檢測靈敏度高于supplier-A,。
產(chǎn)品推薦
產(chǎn)品類型 | 產(chǎn)品名稱 | 貨號 |
高性能PCR單酶系列 | Hieff UNICON® Hotstart E-Taq DNA Polymerase, 5 U/μL | 10726ES |
Hifair®?V Reverse Transcriptase(200 U/μL) | 11300ES | |
Uracil DNA Glycosylase(UDG/UNG),heat-labile, 1 U/μL | 10303ES | |
Murine RNase Inhibitor(40 U/µL) | 10603ES | |
dNTP Mix(25 mM each) | 10125ES | |
超潔凈PCR單酶系列,,超低宿主殘留 | Hieff UCF.ME®?Hotstart Sensitive Taq DNA Polymerase (5 U/μL) | 14314ES |
Hifair UCF.ME®?V Reverse Transcriptase (200 U/μL) | 14608ES | |
UCF.ME®?Uracil DNA Glycosylase(UDG/UNG), heat-labile, 1 U/μL | 14466ES | |
UCF.ME®?Murine RNase Inhibitor(40 U/µL) | 14672ES | |
可凍干PCR單酶系列 | Hieff UNICON® HotStart E-Taq DNA Polymerase, Glycerol-free (5U/μL) | 14316ES |
Hifair®?V Reverse Transcriptase, Glycerol-free(600 U/μL) | 11301ES | |
Uracil DNA Glycosylase(UDG),Heat-Labile(1 U/μL,Glycerol-Free) | 10707ES | |
Murine RNase Inhibitor(200 U/µL,Glycerol-free) | 10703ES | |
RT-qPCR預混液 | 高靈敏快速Hifair® C203P1 Multiplex One Step RT-qPCR Probe Kit(UDG Plus) | 16630ES |
通用全預混Hifair® V Multiplex One Step RT-qPCR Probe Kit(UDG Plus) | 11899ES | |
通用快速可凍干Hifair® Lyo Multiplex One Step RT-qPCR Kit | 11831ES | |
qPCR預混液 | 3代通用全預混Hieff Unicon® Universal TaqMan Pro U+ qPCR Mix(One Tube) | 16710ES |
通用高靈敏Hieff Unicon® Universal TaqMan Multiplex qPCR Master Mix(UDG plus) | 13891ES | |
2代快速全預混Hieff Unicon® SuperproⅠTaqMan qPCR Master Mix(UDG plus) | 11827ES | |
低宿主殘留Hieff Unicon® PureproⅠTaqMan qPCR Master Mix(UDG plus) | 11853ES | |
高靈敏可凍干Hieff Unicon® Universal TaqMan Multiplex qPCR Master Mix(UDG plus) | 11893ES |
相關產(chǎn)品
免責聲明
- 凡本網(wǎng)注明“來源:化工儀器網(wǎng)”的所有作品,均為浙江興旺寶明通網(wǎng)絡有限公司-化工儀器網(wǎng)合法擁有版權或有權使用的作品,,未經(jīng)本網(wǎng)授權不得轉載,、摘編或利用其它方式使用上述作品。已經(jīng)本網(wǎng)授權使用作品的,,應在授權范圍內(nèi)使用,,并注明“來源:化工儀器網(wǎng)”,。違反上述聲明者,,本網(wǎng)將追究其相關法律責任。
- 本網(wǎng)轉載并注明自其他來源(非化工儀器網(wǎng))的作品,,目的在于傳遞更多信息,,并不代表本網(wǎng)贊同其觀點和對其真實性負責,不承擔此類作品侵權行為的直接責任及連帶責任,。其他媒體,、網(wǎng)站或個人從本網(wǎng)轉載時,,必須保留本網(wǎng)注明的作品第一來源,并自負版權等法律責任,。
- 如涉及作品內(nèi)容,、版權等問題,請在作品發(fā)表之日起一周內(nèi)與本網(wǎng)聯(lián)系,,否則視為放棄相關權利,。