雙縮脲法蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法 100T/96S

注意：正式測(cè)定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定,，確保蛋白濃度在 1～10mg/ml 范圍內(nèi),。

測(cè)定意義：

樣品可溶性蛋白質(zhì)含量常常用于酶活性計(jì)算。此外,，可溶性蛋白質(zhì)含量也用于食品等質(zhì)量分析。

測(cè)定原理：

強(qiáng)堿性溶液中,，雙縮脲與 CuSO4 形成紫色絡(luò)合物,；紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無(wú)關(guān),，故可用來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)含量,。該方法測(cè)定范圍為 1~10mg 蛋白質(zhì)，適用于蛋白質(zhì)濃度高的樣品,，尤其是動(dòng)物材料,。

組成：

標(biāo)準(zhǔn)品：液體 1ml×1 瓶，5 mg/ml,，4℃保存,。

自備儀器和用品：

離心機(jī)、可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96 孔板,、移液器和蒸餾水,。

樣品中可溶性蛋白質(zhì)提取提取：

1,、液體樣品：澄清無(wú)色液體樣品可以直接測(cè)定,。

2、組織樣品：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織,，加入 1ml提取液（自備,，根據(jù)需要選用酶提取緩沖液或者蒸餾水或者生理鹽水））

冰浴勻漿，8000g,，4℃離心 10min,，取上清，即待測(cè)液,。（動(dòng)物樣品常常需要稀釋）

3 ,、細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)胞加入 1ml 提取液）,，冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w,，超聲 3 秒，間隔 7 秒,，總時(shí)間 3min）,；然后 8000g，

4℃,，離心 10min,，取上清置于冰上待測(cè)。

測(cè)定操作：

1.   分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱 30 min,，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 540 nm,，蒸餾水調(diào)零。

2.    空白管：取 0.5mL EP 管,，加入 40μl 蒸餾水,，200μl 試劑一，混勻后室溫靜置 15 min,，取 200μl 于微量玻璃比色皿/96 孔板,，540nm 比色，記為A 空白管,。

3.    標(biāo)準(zhǔn)管：取 0.5mL EP 管,，加入 40μl 標(biāo)準(zhǔn)液，200μl 試劑一,，混勻后室溫靜置 15 min,，取 200μl 于微量玻璃比色皿/96 孔板,，540 nm 比色，記為 A 標(biāo)準(zhǔn)管,。

4.    測(cè)定管：取 0.5mL EP 管,，加入 40μl 待測(cè)液，200μl 試劑一,，混勻后室溫靜置 15 min,，取 200μl 于微量玻璃比色皿/96 孔板，540nm 比色,，記為A 測(cè)定管,。

注意：空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需測(cè)定一次。

樣品中蛋白質(zhì)濃度計(jì)算公式:

C 待測(cè)（mg/ml）= C 標(biāo)準(zhǔn)管×(A 測(cè)定管－A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管)

=5×(A 測(cè)定管－A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管)

注意事項(xiàng):

1.  樣品蛋白濃度須在 1～10mg/ml 范圍內(nèi),，低于 1mg/ml 不能用此法,，高于 10mg/ml 須做相應(yīng)稀釋。因此測(cè)定前用 1～2 個(gè)樣做預(yù)實(shí)驗(yàn),，確保蛋白濃度在 1～10mg/ml 范圍內(nèi),。

2.  待測(cè)樣品蛋白提取可用生理鹽水、雙蒸水或不含蛋白的 PBS 提取,。該法受硫酸銨,、Tris 緩沖液干擾，提取液中應(yīng)不含這些物質(zhì),；否則改用BCA 蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒,。