一、檢測原理

本試劑盒采用 ELISA 雙抗體夾心法原理,。用純化的 SARS-CoV-2Nucleoprotein 抗體包被微孔板,，向已包被板微孔中依次加入標(biāo)準(zhǔn)品及待測樣本，同時加入 HRP 標(biāo)記的 SARS-CoV-2Nucleoprotein 抗體,，形成抗體 - 抗原 - 酶標(biāo)檢測抗體復(fù)合物,，經(jīng)過洗滌后加入底物 TMB 顯色。TMB 在 HRP 酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的 SARS-CoV-2Nucleoprotein 呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在 450nm 波長下測定吸光值（OD 值）,，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中 SARS-CoV-2  Nucleoprotein 濃度,。

二、試劑盒組成

三,、其它實驗材料（不提供,，但可協(xié)助購買）

1. 酶標(biāo)儀 (主波長 450nm，參考波長 630nm)

2. 高精度可調(diào)移液器（已校準(zhǔn)）及吸頭：0.5 - 10,2 - 20,20 - 200,200 - 1000μl,。一次檢測樣本較多時,，建議使用多通道移液器。

3. 自動洗板機(jī)或洗瓶

4. 微量振蕩器

5. 雙蒸水或去離子水

6. 坐標(biāo)紙

7. 量筒

四,、注意事項

8. 試劑盒保存在 2 - 8℃,，未用完的標(biāo)準(zhǔn)品，建議丟棄,。不可混合使用不同來源或不同批號的試劑盒組分,，請在有效期內(nèi)使用本產(chǎn)品。

9. 濃縮洗滌液低溫取出可能會伴有結(jié)晶析出,，稀釋時可在水浴中加熱助溶,，不影響使用,。

10. 各步加樣均應(yīng)使用移液器，并經(jīng)過校準(zhǔn),，以免產(chǎn)生誤差,。建議一次加樣時間最好控制在 5 分鐘內(nèi)，如樣本數(shù)量較多,，推薦使用排槍加樣,。

11. 請每次測定的同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線，最好做復(fù)孔,。如樣本中待測物質(zhì)含量高于試劑盒檢測上限（樣本 OD 值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔第一孔的 OD 值）,，請先用樣本稀釋液稀釋一定的倍數(shù)（n 倍）后再測定，計算時需乘以總稀釋倍數(shù),。

12. 為避免交叉污染,，在加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品、不同樣本,、不同試劑時謹(jǐn)記及時更換吸頭,，封板膠紙只限一次性使用。

13. 濃縮酶結(jié)合物及顯色底物請避光保存,，顯色底物在添加之前,，應(yīng)保持無色，請勿使用已變?yōu)樗{(lán)色的顯色底物,。

14. 嚴(yán)格按照說明書的操作進(jìn)行，試驗結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn),。

五,、樣本收集、處理及保存方法

15. 細(xì)胞上清液：將培養(yǎng)基移至離心管內(nèi),，于 4℃下,，1500rpm 離心 10 分鐘，取上清進(jìn)行分裝并在 - 80℃下保存樣品,，盡可能減少反復(fù)凍融次數(shù),。

16. 細(xì)胞提取物：吸取培養(yǎng)基并用預(yù)冷 PBS 洗滌細(xì)胞一次，吸出 PBS,，在 100 mm 培養(yǎng)板加入 0.5ml 提取緩沖液,。收集細(xì)胞至經(jīng)過預(yù)冷的離心管中，短暫渦旋后在冰上孵育 15 - 30 分鐘,，于 4℃下 13000rpm 離心 10 分鐘,，將上清液（這里是指可溶性細(xì)胞提取物）分裝至預(yù)冷的離心管中，并于 - 80℃保存,，盡可能減少反復(fù)凍融次數(shù),。

提取緩沖液：100 mM Tris（pH 7.4）,、150 mM NaCl、1 mM EGTA,、1 mM EDTA,、1% Triton X - 100、0.5% 脫氧膽酸鈉,、磷酸酶抑制劑混合物,、蛋白酶抑制劑混合物、PMSF,。

17. 若樣本無法立即檢測,，請將其按最小使用量分裝， - 20℃ — - 80℃保存,，避免反復(fù)凍融,。如果樣本中含有大量顆粒，檢測前先離心或過濾去除,；室溫下解凍,，請勿于 37℃或更高的溫度加熱解凍。

18. 不能檢測含 NaN3 的樣本,，因 NaN3 抑制辣根過氧化物酶的活性,。

19. 請根據(jù)實際情況，將樣本做適當(dāng)倍數(shù)稀釋（建議根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果確定稀釋倍數(shù)）,。

六,、試劑準(zhǔn)備

20. 試劑回溫：請在實驗前 30min 內(nèi)，將試劑盒和待測樣本置于室溫下回溫,。

21. 洗滌液配制：根據(jù)濃縮洗液的濃縮倍數(shù),，用雙蒸水或去離子水進(jìn)行相應(yīng)倍數(shù)稀釋后備用。

22. 標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋：取出試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品（25ng/ml）,，然后取 5 只聚丙烯試管,，各加入 500μl 標(biāo)準(zhǔn)品 / 樣本稀釋液（S1），按照以下濃度進(jìn)行 2 倍稀釋：25,、12.5,、6.25、3.125,、1.56,、0.78 ng/ml 進(jìn)行稀釋。25ng/ml 為標(biāo)準(zhǔn)曲線最高點濃度,，標(biāo)準(zhǔn)品 / 樣本稀釋液（S1）作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的零點（0ng/ml）,。使用過的標(biāo)準(zhǔn)品原液（25ng/ml）未用完的應(yīng)廢棄或根據(jù)需要按照一次用量分裝，并將其貯存在 - 20～ - 80℃冰箱,。

23. 檢測抗體工作液：根據(jù)試驗所需用量,，用檢測抗體稀釋液（S2）將檢測抗體濃縮液（100×）稀釋成 1 倍應(yīng)用工作液,，請于 30min 內(nèi)使用。

七,、操作步驟

24. 加樣：根據(jù)試驗所需用量,，取出相應(yīng)抗體包被板條，分別將已配制好的標(biāo)準(zhǔn)品,、標(biāo)準(zhǔn)品零點（S1）及待測樣本以 50μl / 孔加入實驗孔底部,，盡量不觸及孔壁，同時,，各實驗孔加入檢測抗體工作液（50μl / 孔）,，充分混勻。

25. 溫育：用封板膜封板后置 37℃溫育 90 分鐘,。

26. 洗滌：小心揭掉封板膜,，棄去液體，甩干,，每孔加滿洗滌液,，靜置 30 秒后棄去，如此重復(fù) 5 次,，拍干,。

27. 顯色：每孔加入 100μl 顯色底物，用封板膠紙封板后室溫顯色 10 - 20min,。

28. 終止：每孔加終止液 50μl（此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）,。

29. 測定：用酶標(biāo)儀 450nm 波長測定各孔的吸光度（OD 值），測定應(yīng)在加終止液后 5min 以內(nèi)進(jìn)行,。

八,、結(jié)果判斷

30. 建議采用雙波長讀數(shù)，即每個標(biāo)準(zhǔn)品和樣本的 450nm OD 值減去 630nm OD 值,，為最終數(shù)值，如果做復(fù)孔,，求其平均值,。

31. 使用計算機(jī)軟件以吸光度 OD 值為縱坐標(biāo) (Y)，相應(yīng)的 SARS-CoV-2Nucleoprotein 標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo) (X),，生成標(biāo)準(zhǔn)曲線,，樣本的 SARS-CoV-2 應(yīng)稀釋倍數(shù)。

本圖僅供參考,，應(yīng)以同次試驗標(biāo)準(zhǔn)品所繪標(biāo)準(zhǔn)曲線為準(zhǔn)

九,、試劑盒性能

批內(nèi)與批間差應(yīng)小于 10%

十、檢測范圍

0.78 ng/ml - 25 ng/ml

十一,、靈敏度

0.4 ng/ml

十二,、常見問題分析及解決辦法