一、miRNA 逆轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量 PCR的概念
miRNA逆轉(zhuǎn)錄的概念
成熟miRNA的長度只有21~23nt,，對(duì)miRNA進(jìn)行qPCR定量時(shí),，無法直接對(duì)其進(jìn)行正、反向引物的設(shè)計(jì)（通常正向引物就足以覆蓋miRNA全長）,，但是可以通過增加逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物長度來解決這一問題,，miRNA的逆轉(zhuǎn)錄方法有兩種,，分別是莖環(huán)法和加尾法。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR的概念
實(shí)時(shí)熒光定量PCR即Real-time PCR,利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程,，最后通過Cr值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模版進(jìn)行定量分析的方法,。

二、miRNA逆轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量PCR的原理

莖環(huán)法原理

莖環(huán)法miRNA逆轉(zhuǎn)錄最關(guān)鍵的一步就是設(shè)計(jì)莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物（由莖環(huán)結(jié)構(gòu)和miRNA的3'末端六個(gè)反向互補(bǔ)的堿基組成）,，莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物首先與miRNA的3'末端結(jié)合,，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下進(jìn)行反應(yīng)，獲得人為加長的miRNA第一鏈cDNA,。針對(duì)不同的miRNA,，需要設(shè)計(jì)不同的莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物、配制不同的逆轉(zhuǎn)錄體系,，因此莖環(huán)法miRNA逆轉(zhuǎn)錄具有特別高的特異性,。

注：莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物中的莖環(huán)結(jié)構(gòu)為固定已知序列，只需按照不同的miRNA序列3'末端的六個(gè)堿基,，將其反向互補(bǔ)添加至莖環(huán)結(jié)構(gòu)序列的3'端即可設(shè)計(jì)出特異性的莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物,。

加尾法原理

增加miRNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物長度最直接的方法就是增加miRNA的長度，加尾法首先通過Poly（A）聚合酶（PAP）向miRNA的3'末端添加Poly（A）尾,，然后在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下,，結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄引物（由3'端帶有錨定堿基的Oligo dT序列和一段通用序列組成），即可獲得加長版的cDNA。加尾法逆轉(zhuǎn)錄可以對(duì)提取純化的所有miRNA進(jìn)行無差別加尾，能夠同時(shí)逆轉(zhuǎn)樣本中多個(gè)miRNA,，一次逆轉(zhuǎn)錄即可完成對(duì)所有qPCR模板的制備,。

注：錨定堿基NV（V代表A,、G或C，N代表ATGC中的任意一種）能夠特異性的結(jié)合到Poly（A）的5'端,，以免逆轉(zhuǎn)出更多的T堿基,，保證同一miRNA的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物大小相同,；在Oligo dT序列的5'端存在一段可用于qPCR檢測(cè)的反向通用引物與cDNA的結(jié)合,。


2,、熒光定量PCR的化學(xué)原理

變產(chǎn)物DNA分子為熒光信號(hào),，通過測(cè)定熒光值即可反映產(chǎn)物DNA分子量,，實(shí)時(shí)熒光定量PCR的化學(xué)方法有兩種，分別是SYBR®Green染料法和 TaqMan®Probe探針法,。

SYBR®Green 染料法原理

一種DNA小溝非飽和性結(jié)合染料，與DNA結(jié)合時(shí)發(fā)光，不結(jié)合（游離）時(shí)不發(fā)光,，每形成一條DNA雙鏈,，就會(huì)有一定數(shù)量的染料結(jié)合上去,，染料一結(jié)合，就會(huì)產(chǎn)生熒光信號(hào),，信號(hào)強(qiáng)度與DNA分子總數(shù)目成正比,。

TaqMan®Probe探針法原理

一種水解探針（5'Reporter，3'Quencher）,，完整時(shí)不發(fā)光,，水解后發(fā)光，每形成一條DNA鏈,，就會(huì)水解一條探針,，每水解一條探針，就會(huì)產(chǎn)生一個(gè)單位信號(hào),，信號(hào)強(qiáng)度與結(jié)合過探針的DNA分子總數(shù)目成正比,。

注：探針要先于引物結(jié)合在模板上，因此Tm（探針）要比Tm（引物）大8～10℃,。

SYBR®Green 染料法 VS TaqMan®Probe探針法原理

SYBR®Green 染料法：表達(dá)量比較高時(shí)推薦使用,；

TaqMan®Probe 探針法原理：表達(dá)量比較低時(shí)推薦使用；

三,、miRNA逆轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量PCR的操作流程
1.莖環(huán)法miRNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
Vazyme 莖環(huán)法 miRNA cDNA 一鏈合成的專用試劑盒 ----------miRNA 1st Stand cDNA Synthesis kit（by stem-loop）(Vazyme #MR101)

Vazyme #MR101 產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)

1.優(yōu)秀的線性關(guān)系：在寬廣的模版區(qū)間內(nèi)具有良好的線性關(guān)系,，可檢出低至pg級(jí)RNA模版。

2.優(yōu)秀的反應(yīng)體系：最適的Buffer組分及濃度,，更適用于miRNA的逆轉(zhuǎn)錄,。

3.簡(jiǎn)便的引物設(shè)計(jì)：提供配套的引物設(shè)計(jì)軟件，使得引物設(shè)計(jì)更加簡(jiǎn)便,。

Vazyme #MR101實(shí)驗(yàn)案例-----優(yōu)秀的線性關(guān)系

以小鼠肝臟組織Total RNA的10倍稀釋梯度（10pg～1μg）為模板,，使用miRNA 1st StrandcDNA Synthesis Kit （by stem-loop） （Vazyme ＃MR101）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA使用miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix（Vazyme ＃MQ101）擴(kuò)增mmu-miR-16基因,。結(jié)果顯示,， 在寬廣的模板區(qū)間內(nèi)，該配套產(chǎn)品具有優(yōu)異的線性關(guān)系,。

·注意事項(xiàng)

1．防止RNase污染：保持實(shí)驗(yàn)區(qū)域潔凈,；操作時(shí)需穿戴干凈的手套、口罩,；實(shí)驗(yàn)所用的離心管,、槍頭等耗材均需保證RNase-free,。

2.5xgDNA Wiper Mix的使用：5xgDNA Wiper Mix含有高濃度的甘油，使用前請(qǐng)短暫離心收集到反應(yīng)管底部,，并用移液器輕輕吹打混勻,。不應(yīng)使槍頭插入液面過深，否則會(huì)因槍頭壁的粘附造成酶量的損失,。

3．反應(yīng)液的配制請(qǐng)?jiān)诒喜僮魍瓿伞?/span>

·實(shí)驗(yàn)流程

1．基因組DNA去除

a.在RNase-free 離心管中配制如下混合液：

用移液器輕輕吹打混勻,。

b.按下列條件進(jìn)行基因組DNA去除反應(yīng)：42°C 2min。

2.第一鏈cDNA合成

a.在RNase-free離心管中配制如下混合液：

莖環(huán)引物推薦使用本公司miRNA Design軟件進(jìn)行設(shè)計(jì),，此時(shí),，cDNA產(chǎn)物后續(xù)定量產(chǎn)品--miRNAUniversal SYBR qPCR Master Mix（Vazyme ＃MQ101）中配套的逆向qPCR引物可直接使用，無需另外設(shè)計(jì)合成,。
用移液器輕輕吹打混勻,。

b.按下列條件進(jìn)行第一鏈cDNA合成反應(yīng)：

如果模版具有復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)或高GC區(qū)域，可將反應(yīng)溫度提高至55°C,，有助于提高產(chǎn)量,。
產(chǎn)物可立即用于qPCR反應(yīng)，短期保存建議存放-20°C,；長期保存建議存放-70°C,；cDNA應(yīng)避免反復(fù)凍融,。

2,、加尾法miRNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

Vazyme 加尾法 miRNA逆轉(zhuǎn)錄是無法使用普通的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄的，因?yàn)槠淙鄙?/span>Poly（A）聚合酶,，無法添加Poly（A）尾,。Vazyme為您提供加尾法miRNA合成cDNA的專用試劑盒-miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit（by tailing A）（Vazyme ＃MR201）。

·Vazyme ＃MR201 產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)

1．特別優(yōu)秀的逆轉(zhuǎn)錄性能：逆轉(zhuǎn)錄效率高且熔解曲線單峰,。

2．超高的逆轉(zhuǎn)錄特異性：專為miRNA逆轉(zhuǎn)錄定向改造的逆轉(zhuǎn)錄酶,，搭配優(yōu)化的緩沖體系，在保證高靈敏度的同時(shí),，最大限度降低 miRNA前體的逆轉(zhuǎn)錄,。

3．簡(jiǎn)便快捷的操作：加尾反應(yīng)與逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)一管進(jìn)行，使得操作更加方便,。

·Vazyme ＃MR201 實(shí)驗(yàn)案例一一超高的逆轉(zhuǎn)錄特異性

以HeLa miRNA為模板（100ng／μl）,，分別使用專為miRNA逆轉(zhuǎn)錄定向改造的逆轉(zhuǎn)錄酶（Vazyme＃MR201）和未定向改造的逆轉(zhuǎn)錄酶（其余組分與Vazyme ＃MR201一致）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，在相同條件下對(duì)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到的cDNA進(jìn)行qPCR檢測(cè)2個(gè)體系,?？梢钥吹剑褂?/span>Vazyme ＃MR201逆轉(zhuǎn)錄 miRNA后qPCR檢測(cè)得到的熔解曲線單峰且峰形優(yōu)異,，特異性更高,。


注意事項(xiàng)
1.防止RNase污染：保持實(shí)驗(yàn)區(qū)域潔凈；操作時(shí)需穿戴干凈的手套、口罩,；實(shí)驗(yàn)所用的離心管,、槍頭等耗材均需保證RNase-free。

2.反應(yīng)液的配制請(qǐng)?jiān)诒喜僮魍瓿伞?/span>

實(shí)驗(yàn)流程

1.在RNase-free離心管中配制如下混合液：

反應(yīng)中使用的Total RNA必須含有miRNA,。
用移液器輕輕吹打混勻,。

2.按下列條件進(jìn)行第一鏈cDNA合成反應(yīng)：

反應(yīng)得到的cDNA可立即或稀釋后用于熒光定量，對(duì)于高豐度表達(dá)的miRNA,，可根據(jù)具體的Cr值,，稀釋10~1000倍。
cDNA應(yīng)避免反復(fù)凍融,，短期保存建議存放-20°C,；長期保存建議存放-70°C。

3,、莖環(huán)法／加尾法miRNA實(shí)時(shí)熒光定量PCR

Vazyme 提供 SYBR Green I嵌合熒光法進(jìn)行miRNA定量反應(yīng)的專用預(yù)混液-miRNA Unimodal SYBR qPCR Master Mix（Vazyme ＃MQ102）,，可同時(shí)兼容莖環(huán)和加尾逆轉(zhuǎn)產(chǎn)物。

Vazyme ＃MQ102 產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)

1.高效實(shí)驗(yàn)：附贈(zèng)U6內(nèi)參上下游引物,，配備莖環(huán)通用下游引物及相關(guān)設(shè)計(jì)軟件,。

2.高靈敏度：可在pg級(jí)的總RNA中檢測(cè)目的miRNA。

3.強(qiáng)特異性：區(qū)分單堿基的差異,，非特異識(shí)別率低于5%,。

Vazyme #MQ102 實(shí)驗(yàn)案例--高效實(shí)驗(yàn)

Vazyme #MQ102配備了miRNA 莖環(huán)引物設(shè)計(jì)軟件和配套下游通用莖環(huán)引物，同時(shí)附贈(zèng)人,、大鼠,、小鼠通用的U6內(nèi)參上下游引物，可在寬廣的定量范圍內(nèi)得到良好的標(biāo)準(zhǔn)曲線,。

Vazyme #MQ102 實(shí)驗(yàn)案例--高靈敏度：

以293T細(xì)胞RNA為模版稀釋6個(gè)梯度（1pg-100ng）,，用miRNA 1st Stand cDNA Synthesis Kit(by stem-loop)(Vazyme #MR101)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得的cDNA用Vazyme

＃MQ102 檢測(cè)hsa-miR-21-5p基因表達(dá)情況,。結(jié)果顯示,，Vazyme ＃MQ102可在pg級(jí)的總RNA中檢測(cè)目的miRNA,且能在寬廣的定量范圍內(nèi)得到良好的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

Vazyme #MQ102 實(shí)驗(yàn)案例--強(qiáng)特異性：

miRNA序列短,，同一家族不同成員序列非常相似,，有些僅有單個(gè)堿基差別，因此特異性對(duì)miRNA定量至關(guān)重要,。Vazyme ＃MQ102核心酶以雙抗封閉,，配以優(yōu)化的Buffer，能夠區(qū)分單堿基的差異,，非特異識(shí)別率低于5％,，實(shí)現(xiàn)高特異性定量,。

莖環(huán)定量引物設(shè)計(jì)

1、正向引物：建議根據(jù)完整miRNA序列除去3'末端6個(gè)堿基的剩余部分作為miRNA正向特異性引物,，并將其中的U替換為T,。也可使用本司提供的miRNA Design軟件設(shè)計(jì)，軟件和說明書請(qǐng)?jiān)凇局Z唯贊-資源支持-實(shí)驗(yàn)工具】處下載,。

2,、反向引物：：莖環(huán)法的qPCR反向通用引物為莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物中莖環(huán)結(jié)構(gòu)序列的一部分，所用莖環(huán)序列為GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC,；本產(chǎn)品提供用于qPCR檢測(cè)的反向通用引物mQ Primer R,，與本公司miRNA Design 軟件設(shè)計(jì)的逆轉(zhuǎn)錄引物配套，無需另外合成,；當(dāng)使用不同的莖環(huán)序列時(shí),，需自行設(shè)計(jì)合成qPCR下游引物。

加尾定量引物設(shè)計(jì)

1．正向引物：

①建議根據(jù)完整miRNA序列設(shè)計(jì)miRNA正向特異性引物,，并將其中的U替換為T,。

②若根據(jù)miRNA序列設(shè)計(jì)的正向特異性引物退火溫度過低，建議在引物5'端增加幾個(gè)堿基（以G和C為主）,，增加堿基后需驗(yàn)證引物特異性,，以免造成非特異性擴(kuò)增；若引物退火溫度過高,，建議刪去5'端幾個(gè)堿基,。

③對(duì)于miRNA前體等長片段非特異性擴(kuò)增，建議在正向特異性引物3'端增加1-3個(gè)A堿基,。

④對(duì)于序列相似的miRNA,，建議正向特異性引物3'端終止于差異堿基，若由于引物長度過短而導(dǎo)致退火溫度過低,，可在引物5'端增加幾個(gè)堿基，使上下游引物Tm值匹配,。反向

2.2,、反向引物：本公司Vazyme ＃MR102中提供用于qPCR檢測(cè)的反向通用引物 Universalreverse Q primer，退火溫度約為66℃,，無需另外合成,；當(dāng)使用不同的逆轉(zhuǎn)錄試劑時(shí)，需自行設(shè)計(jì)合成qPCR逆向引物,。

·注意事項(xiàng)

1．本品盡量避免反復(fù)凍融,，以免造成酶活下降。如每次使用量較少,，推薦小份分裝使用,。

2．使用前請(qǐng)上下顛倒以混勻Master Mix,，請(qǐng)勿vortex避免產(chǎn)生氣泡，影響定量結(jié)果,。MasterMix經(jīng)混勻短暫離心后即可使用,。

3．由于本品中含有熒光染料SYBR Green1，因此需避光保存,，配制反應(yīng)體系時(shí)應(yīng)盡量避免強(qiáng)光照射,。

4．由于本品檢測(cè)靈敏度特高，易被空氣中氣溶膠污染,。因此反應(yīng)體系配制時(shí)請(qǐng)于超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行,，配制過程中請(qǐng)使用滅菌槍頭、反應(yīng)管,，條件容許的實(shí)驗(yàn)室推薦使用專用的移液槍和帶濾芯的槍頭,。

5．本品中的藍(lán)色染料經(jīng)測(cè)試不影響SYBR GreenI熒光的信號(hào)采集。

·實(shí)驗(yàn)流程

1．在qPCR管中配制如下混合液

莖環(huán)法（相對(duì)定量內(nèi)參體系配制參考右表）

加尾法（相對(duì)定量內(nèi)參體系配制參考右表）

2.按下列條件進(jìn)行qPCR反應(yīng)：

miRNA逆轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量PCR的常見FAQ
1.miRNA逆轉(zhuǎn)錄的常見FAQ

莖環(huán)法Vazyme＃MR101能否用于加Poly（A）尾法逆轉(zhuǎn)錄,？

不能,。MR101是通過莖環(huán)法逆轉(zhuǎn)miRNA，利用莖環(huán)引物在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下獲得cDNA,。而加Poly（A）尾法體系中含有兩個(gè)酶的作用,，首先是Poly（A）聚合酶在單鏈RNA的3'端加上一串Poly（A）尾，然后利用體系中的Oligo dT通用型引物在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),。MR101中沒有Poly（A）聚合酶,，故不能用于Poly(A)尾法逆轉(zhuǎn)錄。

為什么莖環(huán)法Vazyme #MR101帶基因組清除組分,，而加尾法Vazyme #MR201不帶基因組清除組分,？
因?yàn)镸R201中的Poly(A)聚合酶（PAP）不能對(duì)基因組DNA進(jìn)行加尾，逆轉(zhuǎn)錄引物無法識(shí)別基因組DNA,，所以MR201中不帶專門基因組清除的組分,。

2、實(shí)時(shí)熒光定量PCR的常見FAQ

·miRNA推薦使用的內(nèi)參：

small nucleolar RNA（snoRNA）長度約為60～300nt左右,，在多種組織細(xì)胞中高表達(dá),，不涉及miRNA的調(diào)節(jié)途徑，所以snoRNA是很好的內(nèi)參選擇,。研究證實(shí)常用的snoRNAassays 包括：

Human:U6,、RNU48、RNU44,、U47;

Mouse:U6,、snoRNA-202、snoRNA-234,、snoRNA-420;

還有一類是在不同實(shí)驗(yàn)條件下變化差異很小的miRNA：

Human/mouse tissues: miR-152,、-186,、-25,、-92,、-26b,、-16;

Human/mouse cell lines: miR-374,、-16,、-93,、-186、-26b;

還有一類是傳統(tǒng)沿用的18S rRNA or U6,。

莖環(huán)法miRNA做逆轉(zhuǎn),、定量時(shí),，內(nèi)參的逆轉(zhuǎn)錄引物和qPCR引物如何設(shè)計(jì),？以常用的U6內(nèi)參為例,，U6的序列足夠長,，因此不需要設(shè)計(jì)莖環(huán)引物（當(dāng)內(nèi)參產(chǎn)物長度在80bp以上時(shí)就不需要設(shè)計(jì)莖環(huán)引物），U6在逆轉(zhuǎn)錄的時(shí)候投入qPCR下游引物即可,，可以看作投入逆轉(zhuǎn)錄的特異性引物逆轉(zhuǎn)，后續(xù)qPCR定量的時(shí)候正常投入上下游引物即可,。

加尾法miRNA做逆轉(zhuǎn),、定量時(shí),，內(nèi)參的逆轉(zhuǎn)錄引物和qPCR引物如何設(shè)計(jì),？加尾法逆轉(zhuǎn)錄可以對(duì)提取純化的所有mRNA和miRNA進(jìn)行無差別加尾，因此不需要對(duì)內(nèi)參做單獨(dú)處理。

擴(kuò)增曲線形狀異常,？

1．?dāng)U增曲線不光滑：信號(hào)太弱,，經(jīng)系統(tǒng)矯正后產(chǎn)生，提高模板濃度重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

2．?dāng)U增曲線斷裂或下滑：模板濃度較高,，基線的終點(diǎn)值大于C4值。減小基線終點(diǎn)（C1值-4）,，重新分析數(shù)據(jù),。

3．個(gè)別擴(kuò)增曲線突然驟降：反應(yīng)管內(nèi)留有氣泡，處理樣本時(shí)要注意離心,，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)之前要仔細(xì)檢查反應(yīng)管內(nèi)是否有氣泡殘留,。

反應(yīng)結(jié)束無擴(kuò)增曲線出現(xiàn)？

1．反應(yīng)循環(huán)數(shù)不夠：一般設(shè)置循環(huán)數(shù)為40,，但需要注意的是過多的循環(huán)會(huì)增加過多的背景信號(hào),，降低數(shù)據(jù)可信度,。

2．確認(rèn)程序中是否設(shè)置了信號(hào)采集步驟：兩步法擴(kuò)增程序一般將信號(hào)采集設(shè)置在退火延伸階段,；三步法擴(kuò)增程序應(yīng)當(dāng)將信號(hào)采集設(shè)置在72℃延伸階段。

3．確認(rèn)引物是否降解：長時(shí)間未用的引物應(yīng)先通過PAGE電泳檢測(cè)完整性，以排除其降解的可能,。

4．模板濃度太低：減少稀釋度重復(fù)實(shí)驗(yàn)，一般未知濃度的樣品先從最高濃度做起,。

5．模板降解：重新制備模板,，重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

Cr值出現(xiàn)太晚,？

1．?dāng)U增效率極低：優(yōu)化反應(yīng)條件,，嘗試三步法擴(kuò)增程序，或者重新設(shè)計(jì)合成引物,。

2．模板濃度太低：減少稀釋度重復(fù)實(shí)驗(yàn),，一般未知濃度的樣品先從最高濃度做起。

3．模板降解：重新制備模板,，重復(fù)實(shí)驗(yàn),。

4．體系中存在PCR抑制劑：一般為模板帶入，加大模板稀釋倍數(shù)或者重新制備模板重復(fù)實(shí)驗(yàn),。

溶解曲線出現(xiàn)多峰,？

1．引物設(shè)計(jì)不優(yōu)：根據(jù)設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)合成新的引物；莖環(huán)法可嘗試引物設(shè)計(jì)時(shí)向前延伸幾個(gè)堿基,，增加引物特異性,。

2．引物濃度太高：適當(dāng)降低引物濃度。

3．cDNA模板帶有基因組污染：重新制備cDNA模板,。

·陰性對(duì)照出現(xiàn)明顯擴(kuò)增,？

1．反應(yīng)體系污染：更換新的Mix、ddH2O,、引物重復(fù)實(shí)驗(yàn),。反應(yīng)體系在超凈工作臺(tái)內(nèi)配制，減少氣溶膠污染,。

2．引物二聚體的出現(xiàn)：配合熔解曲線進(jìn)行分析,。

實(shí)驗(yàn)重復(fù)性差？

1．加樣體積失準(zhǔn)：配制反應(yīng)體系時(shí)盡量使用大體積移液配制,，同時(shí)使用性能較好的移液槍和低吸附耗材,。

2．定量PCR儀不同位置溫度控制不一致：定期校準(zhǔn)儀器。

3．模板濃度太低：模板濃度越低,，重復(fù)性越差,，減少模板稀釋度或提高加樣體積,。

·絕對(duì)定量時(shí)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系不佳？

1．稀釋誤差：采用逐級(jí)稀釋法進(jìn)行模板稀釋,，配制反應(yīng)體系時(shí)盡量使用大體積移液配制,，同時(shí)使用性能較好的移液槍和低吸附耗。
2.系計(jì)算,。

3．引物擴(kuò)增效率差：根據(jù)設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)合成新的引物,。

4．標(biāo)準(zhǔn)品降解：重新制備標(biāo)準(zhǔn)品，重復(fù)實(shí)驗(yàn),。

安培生物致力成為推動(dòng)生命科學(xué)進(jìn)步值得信賴的合作者

深圳/湛江安培生物科技有限公司,是一家具有核心的技術(shù)實(shí)力、先進(jìn)的經(jīng)營管理水平和完善的市場(chǎng)銷售體系的生物高科技企業(yè),?？偛吭O(shè)在廣東,，服務(wù)面向全國。安培生物集進(jìn)口試劑,、實(shí)驗(yàn)室耗材銷售、技術(shù)服務(wù)與合約開發(fā)為一體的專業(yè)化高科技公司,，旨在為生命科學(xué)的發(fā)展提供較好的產(chǎn)品與服務(wù),。本公司建立了涵蓋分子生物學(xué),、細(xì)胞生物學(xué),、免疫學(xué),、信號(hào)傳導(dǎo)和神經(jīng)科學(xué)等領(lǐng)域的產(chǎn)品供應(yīng)線,，在各個(gè)領(lǐng)域內(nèi)向用戶提供較高的水平和質(zhì)量穩(wěn)定的產(chǎn)品,，安培生物致力于為廣大的科研機(jī)構(gòu),、高等院校等客戶提供各種產(chǎn)品、技術(shù)支持與服務(wù),。

可以在第一時(shí)間為用戶提供比較先進(jìn)的專業(yè)資訊和完備的產(chǎn)品和物流服務(wù),。 專業(yè)的技術(shù)力量使得我們能夠?yàn)閺V大用戶提供強(qiáng)大的技術(shù)支持,，深厚的人脈資源使得我們?cè)谌珖饕鞘袚碛斜姸嗟暮献骰锇?，安培生物非常榮幸能將世界上先進(jìn)的高科技產(chǎn)品推薦給國內(nèi)從事生物學(xué)領(lǐng)域科研的老師和同仁。作為專業(yè)性的產(chǎn)品供應(yīng)商,，公司出資存?zhèn)淞舜罅楷F(xiàn)貨,，配合優(yōu)秀的銷售隊(duì)伍以及專業(yè)的技術(shù)支持,，隨時(shí)為客戶提供服務(wù),。