憑借磷酸鈣鹽沉淀法構(gòu)建雙質(zhì)粒穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系
摘要
本文旨在探討利用磷酸鈣鹽沉淀法構(gòu)建表達血管緊張素II受體1型(AT1)和鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性激酶II(CaMKII)的雙質(zhì)粒穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系的可行性,,并分析其在基因功能研究中的應(yīng)用價值。實驗結(jié)果顯示,,磷酸鈣鹽沉淀法能有效實現(xiàn)雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染,,為基因表達與功能研究提供了可靠的平臺。
引言
在分子生物學(xué)和基因工程領(lǐng)域,,質(zhì)粒轉(zhuǎn)染是一種重要的實驗技術(shù),,能夠?qū)⑼庠碊NA引入宿主細胞,從而表達特定的基因或進行基因敲除實驗,。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)在基因功能研究,、藥物篩選、基因治療等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價值,。構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系是實現(xiàn)長期穩(wěn)定表達外源基因的關(guān)鍵步驟,對于深入探究基因功能具有重要意義,。
磷酸鈣鹽沉淀法是一種經(jīng)典的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方法,,具有成本低廉、操作簡便的優(yōu)點,,適用于大多數(shù)類型的細胞,。然而,傳統(tǒng)的磷酸鈣鹽沉淀法主要用于瞬時轉(zhuǎn)染,,對于構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系的研究相對較少,。本文旨在探討利用磷酸鈣鹽沉淀法構(gòu)建雙質(zhì)粒穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系的可行性,并分析其在基因功能研究中的應(yīng)用價值,。
材料與方法
1. 材料
細胞株:COS7細胞
質(zhì)粒:帶HA-tag的AT1質(zhì)粒(WT,,小鼠來源);帶V5-tag的CaMKII質(zhì)粒(δB/WT,,小鼠來源)
試劑:某試劑(包括CaCl?、PBS,、2×HBS緩沖液,、G418等)
儀器:瓊脂糖凝膠電泳儀,、聚丙烯酰胺凝膠電泳及半干法電轉(zhuǎn)儀、熒光顯微鏡等
2. 方法
2.1 質(zhì)粒制備與鑒定
質(zhì)粒擴增與抽提:將AT1和CaMKII質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109中,,擴增后使用Qiagen質(zhì)粒抽提試劑盒進行質(zhì)粒抽提,。
質(zhì)粒鑒定:通過雙酶切法及瓊脂糖電泳鑒定目的DNA片段,,確保質(zhì)粒濃度與純度符合要求,無蛋白和RNA污染,。
2.2 細胞培養(yǎng)與鋪板
細胞培養(yǎng):使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,,在37℃,、5% CO2條件下培養(yǎng)COS7細胞,。
細胞鋪板:待細胞生長至對數(shù)期,用胰酶消化后接種至6孔培養(yǎng)板,,每孔接種2×10^5個細胞,,待細胞貼壁后開始轉(zhuǎn)染,。
2.3 磷酸鈣鹽沉淀法制備與轉(zhuǎn)染
轉(zhuǎn)染前準(zhǔn)備:更換新鮮培養(yǎng)基,,確保細胞密度約為80%,。
制備磷酸鈣-DNA沉淀:將質(zhì)粒DNA(AT1和CaMKII)與CaCl?混合,,再加入2×HBS緩沖溶液,靜置20分鐘后形成磷酸鈣-DNA沉淀,。
細胞轉(zhuǎn)染:將磷酸鈣-DNA沉淀加入細胞培養(yǎng)基中,輕輕搖勻后置于37℃,、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育,。
孵育與篩選:孵育8-24小時后,,更換新鮮培養(yǎng)基,,繼續(xù)培養(yǎng)24小時,。然后使用G418進行抗性篩選,每3-4天更換一次選擇培養(yǎng)基,,直至出現(xiàn)抗藥性的細胞克隆,。
2.4 檢測與鑒定
免疫熒光法(IF):使用熒光顯微鏡觀察細胞表面表達的AT1(及其所帶的HA-tag)和細胞質(zhì)內(nèi)表達的CaMKII(及其所帶的V5-tag)。
免疫印跡法(WB):提取細胞蛋白,,進行SDS-PAGE電泳,,轉(zhuǎn)膜后使用特異性抗體進行Western blot檢測,驗證目的蛋白的表達,。
功能檢測:給予轉(zhuǎn)染細胞血管緊張素II(AngII)刺激,,使用Western blot檢測磷酸化細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(p-ERK)的改變,評估AT1和CaMKII的相互作用,。
實驗結(jié)果
1. 質(zhì)粒鑒定結(jié)果
質(zhì)粒酶切后電泳結(jié)果顯示,,目的長度DNA片段清晰可見,表明質(zhì)粒制備成功,,濃度與純度符合要求,。
2. 細胞轉(zhuǎn)染與篩選結(jié)果
通過磷酸鈣鹽沉淀法將AT1和CaMKII質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至COS7細胞后,經(jīng)過G418抗性篩選,,成功獲得抗藥性的細胞克隆,。免疫熒光法和免疫印跡法檢測結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染細胞中AT1和CaMKII蛋白表達陽性,,而未轉(zhuǎn)染細胞中則無表達,。
3. 功能檢測結(jié)果
給予轉(zhuǎn)染細胞AngII刺激后,Western blot結(jié)果顯示,,轉(zhuǎn)染AT1和CaMKII/WT的細胞產(chǎn)生p-ERK升高反應(yīng),,該反應(yīng)可被AT1受體拮抗劑(ARB)預(yù)處理消除。而未轉(zhuǎn)染細胞及轉(zhuǎn)染AT1和CaMKII/DN的細胞無類似反應(yīng),,進一步證實DN為無功能抑制體,。
討論
1. 磷酸鈣鹽沉淀法在構(gòu)建雙質(zhì)粒穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系中的可行性
本研究成功利用磷酸鈣鹽沉淀法構(gòu)建了表達AT1和CaMKII的雙質(zhì)粒穩(wěn)轉(zhuǎn)COS7細胞系。磷酸鈣鹽沉淀法因其成本低廉,、操作簡便而被廣泛應(yīng)用于瞬時轉(zhuǎn)染,。本研究通過優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件和篩選策略,成功實現(xiàn)了雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染和穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系的構(gòu)建,。這一結(jié)果表明,,磷酸鈣鹽沉淀法在構(gòu)建雙質(zhì)粒穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系中具有可行性。
2. 雙質(zhì)粒穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系在基因功能研究中的應(yīng)用價值
穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系能夠在長時間內(nèi)穩(wěn)定表達外源基因,,為基因功能研究提供了可靠的平臺,。本研究構(gòu)建的雙質(zhì)粒穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系能夠同時表達AT1和CaMKII,,為研究二者在細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的相互作用提供了有力的工具。通過給予AngII刺激,,觀察到p-ERK的改變,,進一步證實了AT1和CaMKII在ERK信號通路中的相互作用。這一結(jié)果為深入探究AT1和CaMKII的功能及其在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用提供了重要線索,。
3. 實驗策略的創(chuàng)新性
本研究在實驗策略上具有以下創(chuàng)新性:
雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染:傳統(tǒng)磷酸鈣鹽沉淀法主要用于瞬時轉(zhuǎn)染,,本研究通過優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件和篩選策略,成功實現(xiàn)了雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染和穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系的構(gòu)建,。
穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系的構(gòu)建:利用G418抗性篩選,,成功獲得抗藥性的細胞克隆,為長期穩(wěn)定的基因表達提供了保障,。
功能檢測:通過給予AngII刺激,,觀察p-ERK的改變,為評估AT1和CaMKII的相互作用提供了直接證據(jù),。
4. 研究的應(yīng)用前景
本研究構(gòu)建的雙質(zhì)粒穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系具有廣泛的應(yīng)用前景:
基因功能研究:可用于深入研究AT1和CaMKII在細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的相互作用及其調(diào)控機制,。
藥物篩選:可作為模型系統(tǒng),用于高通量篩選和評估針對AT1和CaMKII的藥物藥效和安全性,。
疾病模型構(gòu)建:可用于模擬與AT1和CaMKII相關(guān)的疾病狀態(tài),,為疾病機理研究和治療策略開發(fā)提供平臺。
結(jié)論
本研究成功利用磷酸鈣鹽沉淀法構(gòu)建了表達AT1和CaMKII的雙質(zhì)粒穩(wěn)轉(zhuǎn)COS7細胞系,,并驗證了其在基因功能研究中的應(yīng)用價值,。實驗結(jié)果表明,磷酸鈣鹽沉淀法在構(gòu)建雙質(zhì)粒穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系中具有可行性,,且構(gòu)建的雙質(zhì)粒穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系為深入探究AT1和CaMKII的功能及其在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用提供了有力的工具,。本研究為基因功能研究、藥物篩選和疾病模型構(gòu)建提供了新的思路和方法,,具有廣泛的應(yīng)用前景,。
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