吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）試劑盒說(shuō)明書(shū)

分光光度法 50 管/24 樣

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

脯氨酸是植物體內(nèi)適應(yīng)逆境脅迫的一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì),。高等植物中脯氨酸代謝因其初始底物不同,，分為谷氨酸( Glu) 和鳥(niǎo)氨酸( Orn) 兩條合成途徑。

吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS,，Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthetase）是以谷氨酸為前體合成脯氨酸途徑的關(guān)鍵酶，對(duì)植物適應(yīng)逆境脅迫起關(guān)鍵作用,。

測(cè)定原理：

吡咯啉-5-羧酸合成酶催化谷氨酸生成 P5C 過(guò)程中分解ATP 生成ADP 和無(wú)機(jī)磷,，通過(guò)鉬酸銨比色法測(cè)定單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生無(wú)機(jī)磷的量可確定P5CS 活性。

組成：

試劑四用時(shí)加入 25 ml 蒸餾水,，溶解后 4℃保存一周,；試劑五用時(shí)加入 25 ml 蒸餾水，溶解后 4℃保存一周,；

0.5μmol/ml 標(biāo)準(zhǔn)磷應(yīng)用液配制：

將試劑七 20 倍稀釋?zhuān)慈?0.1ml 試劑七加 1.9ml 蒸餾水充分混勻,。

定磷劑的配制：

按H2O: 試劑四:試劑五:試劑六=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷劑應(yīng)為淺黃色。若無(wú)色則試劑失效,，若是藍(lán)色則為磷污染,，定磷劑現(xiàn)用現(xiàn)配。

注意：配試劑最好用新的燒杯,、玻棒和玻璃移液器,，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染,。

自備儀器和用品：

可見(jiàn)外分光光度計(jì),、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋,、可調(diào)式移液器,、1ml 玻璃比色皿、研缽,、冰和蒸餾水,。

樣品酶液的制備：

1、組織樣品：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱(chēng)取約 0.1g 組織,，加入

1ml 試劑一）,，進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min,，取上清,，置冰上待測(cè)。

2,、血清（漿）樣品：直接檢測(cè),。

操作步驟：

1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上,，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 660nm,。

2、酶促反應(yīng)（在EP 管中加入下列試劑）

混勻,，37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其他物種）準(zhǔn)確水浴 10min

混勻,，8000g，25℃離心 10min,，取上清液

3,、定磷（在EP 管或 96 孔板中加入下列試劑）

混勻，室溫放置 30min,，在 660nm 處,，記錄各管吸光值。

注意：

1,、由于每一個(gè)樣都必須做對(duì)照,，本試劑盒 50 管保證測(cè) 24 份P5CS 活性,。

2、此法具有微量,、靈敏,、快速的特點(diǎn)。所以對(duì)測(cè)定所用試管要求嚴(yán)格無(wú)磷,。

3,、空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只要做一管。每個(gè)測(cè)定管設(shè)一個(gè)對(duì)照管,。

計(jì)算

1,、血清（漿）P5CS 活力的計(jì)算:

單位定義：每小時(shí)每毫升血清（漿）中P5CS 消耗ATP 產(chǎn)生 1μmol 無(wú)機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。

P5CS 活力（μmol/h/ml）=C 標(biāo)準(zhǔn)管×（A 測(cè)定管-A 對(duì)照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管）×V 總÷V 樣÷T=9

×（A 測(cè)定管-A 對(duì)照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管）

2,、組織中P5CS 活力的計(jì)算：

（1） 按蛋白濃度計(jì)算：

單位定義：每小時(shí)每毫克組織蛋白中 P5CS 消耗ATP 產(chǎn)生 1μmol 無(wú)機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位,。

P5CS 活力(μmol/h /mg prot)=C 標(biāo)準(zhǔn)管×（A 測(cè)定管-A 對(duì)照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管）×V 總÷（Cpr×V樣）÷T =9 ×（A 測(cè)定管-A 對(duì)照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管）÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計(jì)算：

單位定義：每小時(shí)每克組織中 P5CS 消耗ATP 產(chǎn)生 1μmol 無(wú)機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。

P5CS 活力(μmol/h /g 鮮重)=C 標(biāo)準(zhǔn)管×（A 測(cè)定管-A 對(duì)照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管）×V 總÷(W× V

樣÷V 樣總)÷T=9 ×（A 測(cè)定管-A 對(duì)照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管）÷W

C 標(biāo)準(zhǔn)管：標(biāo)準(zhǔn)管濃度,，0.5μmol/ml,；V 總：酶促反應(yīng)總體積，0.3ml,；V 樣：加入樣本體積,，0.1ml ； V 樣總：加入提取液體積,，1ml,；T：反應(yīng)時(shí)間，1/6 小時(shí),；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/ml；W：樣本鮮重,， g,。