小鼠脾臟是一個(gè)重要的免疫器官,位于小鼠左側(cè)腹腔中,靠近胃的左側(cè),呈長(zhǎng)橢圓形狀,。大小會(huì)根據(jù)小鼠的品種和健康狀況有所不同,,一般來(lái)說(shuō),,成年小鼠的脾臟長(zhǎng)度大約在1.5厘米到2.5厘米之間,。脾臟的顏色和質(zhì)地可能會(huì)因?yàn)樾∈蟮钠贩N和健康狀況而有所變化,,通常呈現(xiàn)出類似葉片的形態(tài),顏色暗紅,。在實(shí)驗(yàn)研究中,,小鼠脾臟細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和計(jì)數(shù)是免疫學(xué)研究的重要方法,,也是流式細(xì)胞術(shù)分析的前提,。
一、耗材與試劑
表1 小鼠脾臟解離部分試劑耗材參考表
材料 | 試劑 | 設(shè)備 |
15/50mL離心管 | 1xPBS緩沖液 | 水平恒溫?fù)u床 |
10cm培養(yǎng)皿 | RPMI 1640培養(yǎng)基 | 血細(xì)胞計(jì)數(shù)板 |
眼科手術(shù)剪,、眼用鑷 | 75%酒精 | 電動(dòng)移液器,、1mL槍頭 |
100μm細(xì)胞篩網(wǎng) | FBS | 高速離心機(jī) |
10mL移液管 | HBSS平衡液溶液 | 渦旋儀 |
5mL流式管 | Absin組織解離試劑盒 | 4℃冰箱 |
| 細(xì)胞染色緩沖液 | 流式細(xì)胞儀 |
表2 產(chǎn)品信息
貨號(hào) | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 | 用途 |
abs50097 | 小鼠脾臟組織解離試劑盒 | 10T/25T | 解離組織 |
abs7303 | 5mL流式管(無(wú)菌無(wú)酶,帶蓋) | 500個(gè)/箱 | 流式管 |
abs9484 | RPMI1640培養(yǎng)基 | 500mL | 保存細(xì)胞活性 |
abs7232 | 70um細(xì)胞篩網(wǎng) | 100個(gè)/箱 | 耗材 |
abs7102 | 15mL離心管(尖底) | 100支/袋 | 耗材 |
abs7100 | 50mL離心管(尖底) | 40支/袋 | 耗材 |
abs962 | PBS緩沖液(1x) | 500mL | 試劑 |
abs9475 | 細(xì)胞染色緩沖液 | 500mL | 試劑 |
abs9101 | 紅細(xì)胞裂解液(1x) | 100mL/500mL | 裂紅液 |
二、實(shí)驗(yàn)步驟
實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備:將脾臟小鼠脾臟組織解離試劑盒至于37度水浴鍋中預(yù)熱(脾臟組織解離試劑收到后,,推薦分裝凍存),,如果使用紅細(xì)胞裂解液為10×,需提前用超純水稀釋成1×,。PBS提前預(yù)冷,。
1、將小鼠頸部脫臼處死,,75%酒精消毒小鼠表面,,至于托盤(pán)中,左側(cè)腹部朝上,,鑷子輔助操作,,提起左腹側(cè)中部皮膚,剪開(kāi)皮膚,,肉眼可見(jiàn)暗紅色,,長(zhǎng)條狀脾臟,剪開(kāi)腹膜,,鑷子提起脾臟,,見(jiàn)到分離,盡可能的除去結(jié)締組織和脂肪,,PBS沖洗,,取新鮮小鼠脾臟組織100mg-200mg左右(一個(gè)20g的小鼠,脾臟重量可能在100mg左右,,具體以實(shí)際情況為準(zhǔn))加至50mL無(wú)菌離心管中,,用眼科剪將組織che底剪碎至1-2mm3,加入小鼠脾臟組織解離試劑1mL,;
2,、將離心管置于恒溫?fù)u床上,,37℃/180rpm震蕩孵育30min左右,消化小鼠脾臟組織,,可根據(jù)組織狀態(tài)適當(dāng)調(diào)整消化時(shí)間(脾臟相對(duì)比較好消化),,混懸液中肉眼無(wú)明顯組織塊時(shí),取少量懸液倒置顯微鏡下觀察,,可輔助判斷,,有大量活細(xì)胞即可停止消化(中心明亮),也可用臺(tái)盼藍(lán)染色或者其他方式,;
紅色圈內(nèi):死細(xì)胞 綠色圈內(nèi):活細(xì)胞
3,、孵育結(jié)束后將離心管內(nèi)的組織勻漿用70um無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾,然后加入細(xì)胞培養(yǎng)基沖洗無(wú)菌過(guò)濾器,,用50mL的離心管收集濾液,;
4、將收集的濾液1200rpm離心5min ,,棄上清,;
5、可使用紅細(xì)胞裂解液去除組織解離過(guò)程中的紅細(xì)胞,,具體操作為,,向第4步所得的沉淀加入3mL 1×紅細(xì)胞裂解液,重懸沉淀,,渦旋混勻,,室溫下避光孵育3-5min,加入2mL預(yù)冷的PBS, 1200rpm離心 5min,,棄上清,。重復(fù)洗滌一次;
6,、棄上清,,細(xì)胞染色緩沖液重懸細(xì)胞沉淀,并調(diào)整細(xì)胞濃度至5-10×106個(gè)細(xì)胞/mL,,將100uL/管的細(xì)胞懸液分配到12×75mm的流式管中,,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
三,、問(wèn)題及策略
1,、細(xì)胞得率低
一般情況下,,成年C57BL/6小鼠一個(gè)脾臟可解離出大約10×108–1.4×108個(gè)細(xì)胞,,如果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞得率特別低,需要注意,,樣本獲取階段要盡可能完quan去除組織周?chē)闹?,盡可能將組織剪碎,,從而提高細(xì)胞產(chǎn)量。在涉及的清洗步驟中,,倒出上清液前,,先用移液槍吸棄上層脂肪(可將槍頭jian端修剪一下,避免吸氣時(shí)堵塞)
2,、細(xì)胞活率低,,死細(xì)胞/碎片多
首先,解離試劑孵育的時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng),,長(zhǎng)時(shí)間孵育會(huì)造成細(xì)胞活力降低及表面標(biāo)記物丟失,,死細(xì)胞過(guò)多,釋放DNA絲纏繞,,導(dǎo)致溶液粘稠,,其次,千萬(wàn)不要縮短清洗的步驟,,清洗可以幫助去除粘連體,、碎片和死細(xì)胞,紅細(xì)胞裂解液的孵育時(shí)間也不能過(guò)長(zhǎng),,一般5min即可,,如果細(xì)胞活力還是很低,建議檢查紅細(xì)胞裂解液是否新鮮有效,。
3,、紅細(xì)胞裂解不wan全
表現(xiàn)為洗滌步驟后出現(xiàn)明顯的紅色沉淀。確保制備新鮮的紅細(xì)胞裂解緩沖液,,在室溫下進(jìn)行裂解,。裂解開(kāi)始前,要確保細(xì)胞已wan全重懸,,裂解時(shí)間不能過(guò)短,。
四、解離效果
該試劑盒講小鼠Spleen組織處理為單細(xì)胞懸液后做流式:細(xì)胞活力,、CD45,、CD3、CD4,、CD8染色結(jié)果
注:本產(chǎn)品僅作科研實(shí)驗(yàn)使用,,不支持臨床等研究
五、其他產(chǎn)品推薦
貨號(hào) | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 |
abs9907 | 流式絕對(duì)計(jì)數(shù)管 | 50T |
abs9477 | 小鼠Fc受體阻斷劑 | 200T/500T |
abs9476 | 人Fc受體阻斷劑 | 50T/200T |
abs9488 | 鞘液 | 20L |
abs9107 | 佛波酯 | 1mg/5mg/25mg |
abs9108 | 離子霉素鈣鹽 | 1mg/5mg |
abs970 | D-PBS緩沖液(1×,無(wú)鈣鎂) | 500mL |
abs810012 | Brefeldin A | 10mg/25mg/50mg |
abs812975 | Monensin sodium salt | 25mg/100mg |
abs9475 | 細(xì)胞染色緩沖液 | 500mL |
abs9110 | 固定劑 | 50mL |
abs9111 | 破膜劑 | 150mL |
abs7303 | 5mL流式管(無(wú)菌無(wú)酶,帶蓋) | 1箱 |
abs1840002 | APC Mouse anti-Human CD3 Antibody(3JI3-9) | 25T/100T |
abs182427 | PE Mouse anti-Human CD4 Antibody(5D4) | 25T/100T |
abs182430 | FITC Mouse anti-Human CD8 Antibody(3C4) | 25T/100T |
abs180046 | PE-Cy7 Mouse anti-Human CD25 Antibody(BC96) | 25T/100T |
abs1840696 | FITC Mouse anti-Human CD80 Antibody(2D10.4) | 25T/100T |
abs182338 | APC Rat anti-Mouse CD25 Antibody(4APC61.5) | 25T/100T |
More...... |
Absin產(chǎn)品線:
爆款產(chǎn)品:試劑盒(mIHC,、IHC,、凋亡、ELISA,、ChIP,、Co-IP,、TR-FRET、生化檢測(cè),、殘留檢測(cè),、多因子檢測(cè));細(xì)胞培養(yǎng)(類器官試劑盒+基質(zhì)膠,,胎牛血清+培養(yǎng)添加劑+細(xì)胞因子),、分化試劑盒;分子(mRNA合成服務(wù)+提取試劑盒),;化合物大包裝,;輔助試劑、耗材/儀器,、定制服務(wù)(抗體/多肽/蛋白/標(biāo)記/檢測(cè))...
特色產(chǎn)品:雞胚提取物CEE,、B27、N2,、霍亂毒素B亞單位CTB,、牛腦垂體提取物BPE、百日咳毒素PTX,、重組人胰島素Insulin,、人源低密度脂蛋白LDL...
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