小鼠脾臟是一個(gè)重要的免疫器官，位于小鼠左側(cè)腹腔中，靠近胃的左側(cè)，呈長(zhǎng)橢圓形狀,。大小會(huì)根據(jù)小鼠的品種和健康狀況有所不同,，一般來(lái)說(shuō),，成年小鼠的脾臟長(zhǎng)度大約在1.5厘米到2.5厘米之間,。脾臟的顏色和質(zhì)地可能會(huì)因?yàn)樾∈蟮钠贩N和健康狀況而有所變化,，通常呈現(xiàn)出類似葉片的形態(tài)，顏色暗紅,。在實(shí)驗(yàn)研究中,，小鼠脾臟細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和計(jì)數(shù)是免疫學(xué)研究的重要方法,，也是流式細(xì)胞術(shù)分析的前提,。

一、耗材與試劑

表1 小鼠脾臟解離部分試劑耗材參考表

表2 產(chǎn)品信息

二、實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：將脾臟小鼠脾臟組織解離試劑盒至于37度水浴鍋中預(yù)熱（脾臟組織解離試劑收到后,，推薦分裝凍存）,，如果使用紅細(xì)胞裂解液為10×，需提前用超純水稀釋成1×,。PBS提前預(yù)冷,。

1、將小鼠頸部脫臼處死,，75%酒精消毒小鼠表面,，至于托盤(pán)中，左側(cè)腹部朝上,，鑷子輔助操作,，提起左腹側(cè)中部皮膚，剪開(kāi)皮膚,，肉眼可見(jiàn)暗紅色,，長(zhǎng)條狀脾臟，剪開(kāi)腹膜,，鑷子提起脾臟,，見(jiàn)到分離，盡可能的除去結(jié)締組織和脂肪,，PBS沖洗,，取新鮮小鼠脾臟組織100mg-200mg左右（一個(gè)20g的小鼠，脾臟重量可能在100mg左右,，具體以實(shí)際情況為準(zhǔn)）加至50mL無(wú)菌離心管中,，用眼科剪將組織che底剪碎至1-2mm³，加入小鼠脾臟組織解離試劑1mL,；

2,、將離心管置于恒溫?fù)u床上,，37℃/180rpm震蕩孵育30min左右，消化小鼠脾臟組織,，可根據(jù)組織狀態(tài)適當(dāng)調(diào)整消化時(shí)間（脾臟相對(duì)比較好消化）,，混懸液中肉眼無(wú)明顯組織塊時(shí)，取少量懸液倒置顯微鏡下觀察,，可輔助判斷,，有大量活細(xì)胞即可停止消化（中心明亮），也可用臺(tái)盼藍(lán)染色或者其他方式,；

紅色圈內(nèi)：死細(xì)胞 綠色圈內(nèi)：活細(xì)胞

3,、孵育結(jié)束后將離心管內(nèi)的組織勻漿用70um無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾，然后加入細(xì)胞培養(yǎng)基沖洗無(wú)菌過(guò)濾器,，用50mL的離心管收集濾液,；

4、將收集的濾液1200rpm離心5min ,，棄上清,；

5、可使用紅細(xì)胞裂解液去除組織解離過(guò)程中的紅細(xì)胞,，具體操作為,，向第4步所得的沉淀加入3mL 1×紅細(xì)胞裂解液，重懸沉淀,，渦旋混勻,，室溫下避光孵育3-5min，加入2mL預(yù)冷的PBS, 1200rpm離心 5min,，棄上清,。重復(fù)洗滌一次；

6,、棄上清,，細(xì)胞染色緩沖液重懸細(xì)胞沉淀，并調(diào)整細(xì)胞濃度至5-10×10⁶個(gè)細(xì)胞/mL,，將100uL/管的細(xì)胞懸液分配到12×75mm的流式管中,，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

三,、問(wèn)題及策略

1,、細(xì)胞得率低

一般情況下,，成年C57BL/6小鼠一個(gè)脾臟可解離出大約10×10⁸–1.4×10⁸個(gè)細(xì)胞,，如果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞得率特別低，需要注意,，樣本獲取階段要盡可能完quan去除組織周?chē)闹?，盡可能將組織剪碎,，從而提高細(xì)胞產(chǎn)量。在涉及的清洗步驟中,，倒出上清液前,，先用移液槍吸棄上層脂肪（可將槍頭jian端修剪一下，避免吸氣時(shí)堵塞）

2,、細(xì)胞活率低,，死細(xì)胞/碎片多

首先，解離試劑孵育的時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng),，長(zhǎng)時(shí)間孵育會(huì)造成細(xì)胞活力降低及表面標(biāo)記物丟失,，死細(xì)胞過(guò)多，釋放DNA絲纏繞,，導(dǎo)致溶液粘稠,，其次，千萬(wàn)不要縮短清洗的步驟,，清洗可以幫助去除粘連體,、碎片和死細(xì)胞，紅細(xì)胞裂解液的孵育時(shí)間也不能過(guò)長(zhǎng),，一般5min即可,，如果細(xì)胞活力還是很低，建議檢查紅細(xì)胞裂解液是否新鮮有效,。

3,、紅細(xì)胞裂解不wan全

表現(xiàn)為洗滌步驟后出現(xiàn)明顯的紅色沉淀。確保制備新鮮的紅細(xì)胞裂解緩沖液,，在室溫下進(jìn)行裂解,。裂解開(kāi)始前，要確保細(xì)胞已wan全重懸,，裂解時(shí)間不能過(guò)短,。

四、解離效果

該試劑盒講小鼠Spleen組織處理為單細(xì)胞懸液后做流式：細(xì)胞活力,、CD45,、CD3、CD4,、CD8染色結(jié)果

注：本產(chǎn)品僅作科研實(shí)驗(yàn)使用,，不支持臨床等研究

五、其他產(chǎn)品推薦

Absin產(chǎn)品線：

爆款產(chǎn)品：試劑盒(mIHC,、IHC,、凋亡、ELISA,、ChIP,、Co-IP,、TR-FRET、生化檢測(cè),、殘留檢測(cè),、多因子檢測(cè))；細(xì)胞培養(yǎng)(類器官試劑盒+基質(zhì)膠,，胎牛血清+培養(yǎng)添加劑+細(xì)胞因子),、分化試劑盒；分子(mRNA合成服務(wù)+提取試劑盒),；化合物大包裝,；輔助試劑、耗材/儀器,、定制服務(wù)(抗體/多肽/蛋白/標(biāo)記/檢測(cè))...

特色產(chǎn)品：雞胚提取物CEE,、B27、N2,、霍亂毒素B亞單位CTB,、牛腦垂體提取物BPE、百日咳毒素PTX,、重組人胰島素Insulin,、人源低密度脂蛋白LDL...