人前列腺癌細胞LNCaP Clone FGC,，是1977年從一位50歲白人男性（血型B+）的左鎖骨淋巴結(jié)針刺活檢中分離的，當時該患者已確診為轉(zhuǎn)移性前列腺癌。根據(jù)報道,，該細胞對5-α-二氫睪酮（生長調(diào)節(jié)并生成酸性磷酸酶ACP）有響應(yīng),。

01,該細胞并不形成一致的單層,，而是形成集落,；

02,該細胞會使培養(yǎng)基快速變酸，且生長緩慢,，故傳代后 48 小時內(nèi)不應(yīng)擾動,；

03,普通TC處理的培養(yǎng)瓶或皿不能使細胞很好的貼壁，培養(yǎng)難度較高,，需使用 Corning 的 cellbind 細胞培養(yǎng)瓶（貨號是 3289）,，或者使用多聚-L-賴氨酸溶液（貨號 PB180523）包被過的培養(yǎng)皿；

04,在細胞運輸途中,，多數(shù)細胞會從培養(yǎng)瓶底分離,，大片懸浮在培養(yǎng)基中，按照收貨注意事項處理即可恢復(fù)正常,。

收貨處理方式

收貨后，如果發(fā)現(xiàn)細胞漂浮或成團，可按下面的步驟進行處理：

01,將培養(yǎng)瓶內(nèi)的所有培養(yǎng)基,，轉(zhuǎn)入無菌離心管,，離心收集細胞（1200rpm 3min）；

02,去掉上清,，用PBS重懸細胞,，將細胞收集到一個離心管中，PBS震動離心管混勻即可,，再次離心（1200rpm 3min）,；

03,去掉上清，加入1ml左右0.25%胰酶,，重懸混勻細胞,。震動離心管，混勻即可,，不能吹打,。放入培養(yǎng)箱，消化細胞,，消化時間3分鐘左右,；

04,消化完畢后，用移液槍輕輕吹打細胞懸液,，使細胞團分散,。加入5ml含血清的培養(yǎng)基，混勻后終止消化,，離心（1200rpm 3min）,；

05,去掉上清，加入5-7ml相應(yīng)培養(yǎng)基混勻,，輕輕/反復(fù)吹打細胞,，接種于無菌T25瓶中（接種容器應(yīng)提前用對應(yīng)培養(yǎng)基浸潤）。

▲ 細胞到貨漂浮

▲ 細胞接種量少

傳代步驟

01,吸出原培養(yǎng)液,；

02,加入2ml左右PBS,，輕輕晃動培養(yǎng)瓶，潤洗細胞,，吸出PBS,，丟棄；

03,加入1ml左右胰酶,，輕輕晃動培養(yǎng)瓶,，使之浸潤所有細胞；

04,放入培養(yǎng)箱消化,，消化5分鐘左右,，顯微鏡下可看到，細胞塊中間的細胞明顯分離變圓，且自然脫落（全程不要拍打培養(yǎng)瓶）,；

05,加入3ml含血清的培養(yǎng)基,，終止消化，輕輕/反復(fù)吹打細胞,，在顯微鏡下觀察,。細胞懸液中，細胞盡量為單個狀態(tài),；

06,收集細胞懸液,，離心（1200rpm 3min）。離心完,，吸出上清,，丟棄；

07,加入新鮮培養(yǎng)基,，吹打幾下,，混勻細胞即可。按需接種到新培養(yǎng)瓶,，補充足量培養(yǎng)基,，擰松瓶蓋，或使用透氣瓶蓋進行培養(yǎng),；

08,檢查培養(yǎng)箱的二氧化碳,、溫度及水盤。

傳代比例和頻次

推薦1:2~1:4傳代,，每4~5天傳代一次,。

換液步驟

吸出舊培養(yǎng)基，沿培養(yǎng)瓶側(cè)邊加入新培養(yǎng)基,；

每3天換液一次,。

凍存步驟

01,配置凍存液。推薦配比：55%（基礎(chǔ)培養(yǎng)基1640）+40%(血清)+5%（DMSO）,；

02,DMSO配置時會放熱,，一定要等凍存液冷卻后再使用，避免灼傷細胞,；

03,細胞消化好后用新鮮培養(yǎng)基中止,，制成細胞懸液；

04,1200rpm 3min 離心后去上清,，盡量吸干凈上清,；

05,加入配置好的凍存液，重懸,，建議一個T25長滿凍存1支,，或者細胞計數(shù)后,，按照2-5×10⁶cells/支的比例凍存；

06,將分裝好的凍存液轉(zhuǎn)入程序凍存盒,，放入-80℃冰箱過夜,；

07,從-80℃冰箱取出凍存管,，迅速轉(zhuǎn)移到液氮,，長期保存。

復(fù)蘇步驟

01,將水浴鍋預(yù)熱至37℃,，準備好干凈的一次性手套,，向一個無菌離心管內(nèi)，加入9ml無菌培養(yǎng)基,；

02,將細胞從液氮罐中取出,，放入一次性手套中，迅速沒入水浴鍋,。搖晃凍存管加速溶解,，以1分鐘內(nèi)全部溶解為宜；

03,在超凈臺中,，將復(fù)蘇好的細胞液,，加入到裝有新鮮培養(yǎng)基的離心管內(nèi)，1200rpm/min離心3分鐘,，離心完畢,，去掉上清；

04,用適量與細胞對應(yīng)的培養(yǎng)基重懸細胞,，接入到無菌容器（培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿）中,，補充一定量培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng),；

05,溶解過程要迅速,，已溶解的凍存細胞不能在常溫下存放太久，需盡快離心去除DMSO,。