人前列腺癌細胞LNCaP Clone FGC,,是1977年從一位50歲白人男性(血型B+)的左鎖骨淋巴結(jié)針刺活檢中分離的,當時該患者已確診為轉(zhuǎn)移性前列腺癌。根據(jù)報道,,該細胞對5-α-二氫睪酮(生長調(diào)節(jié)并生成酸性磷酸酶ACP)有響應(yīng),。
01,該細胞并不形成一致的單層,,而是形成集落,;
02,該細胞會使培養(yǎng)基快速變酸,且生長緩慢,,故傳代后 48 小時內(nèi)不應(yīng)擾動,;
03,普通TC處理的培養(yǎng)瓶或皿不能使細胞很好的貼壁,培養(yǎng)難度較高,,需使用 Corning 的 cellbind 細胞培養(yǎng)瓶(貨號是 3289),,或者使用多聚-L-賴氨酸溶液(貨號 PB180523)包被過的培養(yǎng)皿;
04,在細胞運輸途中,,多數(shù)細胞會從培養(yǎng)瓶底分離,,大片懸浮在培養(yǎng)基中,按照收貨注意事項處理即可恢復(fù)正常,。
收貨處理方式
收貨后,如果發(fā)現(xiàn)細胞漂浮或成團,可按下面的步驟進行處理:
01,將培養(yǎng)瓶內(nèi)的所有培養(yǎng)基,,轉(zhuǎn)入無菌離心管,,離心收集細胞(1200rpm 3min);
02,去掉上清,,用PBS重懸細胞,,將細胞收集到一個離心管中,PBS震動離心管混勻即可,,再次離心(1200rpm 3min),;
03,去掉上清,加入1ml左右0.25%胰酶,,重懸混勻細胞,。震動離心管,混勻即可,,不能吹打,。放入培養(yǎng)箱,消化細胞,,消化時間3分鐘左右,;
04,消化完畢后,用移液槍輕輕吹打細胞懸液,,使細胞團分散,。加入5ml含血清的培養(yǎng)基,混勻后終止消化,,離心(1200rpm 3min),;
05,去掉上清,加入5-7ml相應(yīng)培養(yǎng)基混勻,,輕輕/反復(fù)吹打細胞,,接種于無菌T25瓶中(接種容器應(yīng)提前用對應(yīng)培養(yǎng)基浸潤)。
▲ 細胞到貨漂浮
▲ 細胞接種量少
傳代步驟
01,吸出原培養(yǎng)液,;
02,加入2ml左右PBS,,輕輕晃動培養(yǎng)瓶,潤洗細胞,,吸出PBS,,丟棄;
03,加入1ml左右胰酶,,輕輕晃動培養(yǎng)瓶,,使之浸潤所有細胞;
04,放入培養(yǎng)箱消化,,消化5分鐘左右,,顯微鏡下可看到,細胞塊中間的細胞明顯分離變圓,且自然脫落(全程不要拍打培養(yǎng)瓶),;
05,加入3ml含血清的培養(yǎng)基,,終止消化,輕輕/反復(fù)吹打細胞,,在顯微鏡下觀察,。細胞懸液中,細胞盡量為單個狀態(tài),;
06,收集細胞懸液,,離心(1200rpm 3min)。離心完,,吸出上清,,丟棄;
07,加入新鮮培養(yǎng)基,,吹打幾下,,混勻細胞即可。按需接種到新培養(yǎng)瓶,,補充足量培養(yǎng)基,,擰松瓶蓋,或使用透氣瓶蓋進行培養(yǎng),;
08,檢查培養(yǎng)箱的二氧化碳,、溫度及水盤。
傳代比例和頻次
推薦1:2~1:4傳代,,每4~5天傳代一次,。
換液步驟
吸出舊培養(yǎng)基,沿培養(yǎng)瓶側(cè)邊加入新培養(yǎng)基,;
每3天換液一次,。
凍存步驟
01,配置凍存液。推薦配比:55%(基礎(chǔ)培養(yǎng)基1640)+40%(血清)+5%(DMSO),;
02,DMSO配置時會放熱,,一定要等凍存液冷卻后再使用,避免灼傷細胞,;
03,細胞消化好后用新鮮培養(yǎng)基中止,,制成細胞懸液;
04,1200rpm 3min 離心后去上清,,盡量吸干凈上清,;
05,加入配置好的凍存液,重懸,,建議一個T25長滿凍存1支,,或者細胞計數(shù)后,,按照2-5×106cells/支的比例凍存;
06,將分裝好的凍存液轉(zhuǎn)入程序凍存盒,,放入-80℃冰箱過夜,;
07,從-80℃冰箱取出凍存管,,迅速轉(zhuǎn)移到液氮,,長期保存。
復(fù)蘇步驟
01,將水浴鍋預(yù)熱至37℃,,準備好干凈的一次性手套,,向一個無菌離心管內(nèi),加入9ml無菌培養(yǎng)基,;
02,將細胞從液氮罐中取出,,放入一次性手套中,迅速沒入水浴鍋,。搖晃凍存管加速溶解,,以1分鐘內(nèi)全部溶解為宜;
03,在超凈臺中,,將復(fù)蘇好的細胞液,,加入到裝有新鮮培養(yǎng)基的離心管內(nèi),1200rpm/min離心3分鐘,,離心完畢,,去掉上清;
04,用適量與細胞對應(yīng)的培養(yǎng)基重懸細胞,,接入到無菌容器(培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿)中,,補充一定量培養(yǎng)基,放入培養(yǎng)箱培養(yǎng),;
05,溶解過程要迅速,,已溶解的凍存細胞不能在常溫下存放太久,需盡快離心去除DMSO,。
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