蛋白質(zhì)設(shè)計的目標(biāo)是創(chuàng)建具有特定功能的蛋白質(zhì),，目前，基于物理的方法雖然能夠提供詳細的結(jié)構(gòu)信息，但成功率相對較低,。相比之下,，基于機器學(xué)習(xí)的方法顯著提高了設(shè)計的成功率，但設(shè)計失敗的情況仍然普遍,。而且,，無論采用哪種方法，最終都需要通過實驗來驗證設(shè)計的蛋白質(zhì)是否具有預(yù)期的功能,。當(dāng)前主要的挑戰(zhàn)是從數(shù)十到數(shù)百個設(shè)計中篩選出那些具有預(yù)期功能的蛋白質(zhì),，并且要明確設(shè)計失敗的原因，包括表達和可溶性問題以及未能形成正確的結(jié)構(gòu)和功能的原因,。因此,，尋找一種高效、便捷的方法來篩選和驗證蛋白質(zhì)設(shè)計顯得尤為重要,。

無細胞蛋白合成（CFPS）提供了一種更為簡單的方法來識別功能性設(shè)計，并能解釋設(shè)計為何未能如預(yù)期般表現(xiàn),。CFPS相比在傳統(tǒng)生產(chǎn)重組蛋白的方法具有多個優(yōu)勢,，如不受宿主細胞存活限制、可生產(chǎn)細胞毒性蛋白,、反應(yīng)僅由目標(biāo)DNA編程、條件易于調(diào)整,、適合小體積篩選且成本低。此外,，CFPS更便于生產(chǎn)制造和測試設(shè)計蛋白的功能,，并探索設(shè)計失敗的原因,，從而可以提供豐富的數(shù)據(jù)集以優(yōu)化后續(xù)設(shè)計等。

在蛋白質(zhì)設(shè)計中，篩選活性是關(guān)鍵步驟之一,。CFPS作為一種高效且靈活的方法,，在這一過程中發(fā)揮了重要作用,，它可以快速評估蛋白質(zhì)的活性,，同時還能幫助識別設(shè)計失敗的原因,。此外,，CFPS可以在微孔板或微流控設(shè)備中進行,，反應(yīng)體積小,，適合大規(guī)模篩選,。例如，通過熒光或比色法可以直接檢測酶活性,，而無需復(fù)雜的純化步驟,。CFPS還可以用于高通量篩選，例如Rapp等人通過機器人自動化系統(tǒng)結(jié)合CFPS來探索蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性和活性,。這種方法不僅提高了篩選效率，還能夠在短時間內(nèi)排除無效的設(shè)計,。從而快速篩選出功能性蛋白質(zhì),，還能為設(shè)計失敗提供寶貴的信息，從而指導(dǎo)后續(xù)的設(shè)計改進,，例如，de los Santos等人通過CFPS篩選出具有特定DNA結(jié)合活性的轉(zhuǎn)錄抑制因子突變體,，Rolf等人通過優(yōu)化反應(yīng)條件提高酶的可溶性產(chǎn)量?？傊?，CFPS是一種簡單,、信息豐富且易于操作的技術(shù),，非常適合用于蛋白質(zhì)設(shè)計和驗證流程。

蛋白質(zhì)表面捕獲是評估蛋白質(zhì)功能的重要手段,。通過將蛋白質(zhì)產(chǎn)品固定到固體表面上,，可以將其與CFPS試劑分離,，從而通過清洗表面實現(xiàn)這一目的。這使得可以在不同條件下測試蛋白質(zhì)活性,，如pH值,、溫度、緩沖液成分以及對不同底物的反應(yīng)性,。并且可以測試每個突變體在多種條件下的表現(xiàn),。如，PISA（Protein In Situ Array）技術(shù)通過鎳涂層表面捕獲帶有His標(biāo)簽的蛋白質(zhì),，實現(xiàn)高通量功能檢測,。最近，Thornton將自組裝蛋白質(zhì)表面用于共價捕獲無細胞合成的蛋白質(zhì),。具體來說，可通過His標(biāo)簽蛋白,、生物素化的DNA,、BslA-SpyTag 形成自組裝蛋白質(zhì)單層等策略來實現(xiàn)表面補獲,。這些方法不僅能夠高效地捕獲蛋白質(zhì),，還能夠在不同的實驗條件下進行蛋白質(zhì)功能的測試,，從而為蛋白質(zhì)設(shè)計和功能研究提供了強大的工具,。