一: 細(xì)胞培養(yǎng)

熒光顯微鏡對于直接用培養(yǎng)皿拍攝都沒有什么壓力,，不過依然更建議做爬片,，不僅效果更好而且更適合拍共聚焦,，不想拍了也可以冷凍保存,。爬片的預(yù)處理需要用多聚賴氨酸增加細(xì)胞粘附性

1，用多聚賴氨酸涂在爬片上放置30-120分鐘,。

2,，然后用滅菌的超純水清洗和浸泡,。

3,，自然干燥了之后放在紫外下照射至少1個(gè)小時(shí)以上,。爬片之前經(jīng)過高溫滅菌的可以不需要這么久。

4,，如果用普通蓋玻片而不是專用細(xì)胞爬片的話,，一般還需要用0.1% Tween-20的PBS洗一下，因?yàn)楦鶕?jù)我的經(jīng)驗(yàn)，幾個(gè)牌子的普通蓋玻片都比較臟,，不能直接用,。

5，在培養(yǎng)皿內(nèi)滴100uL左右的培養(yǎng)基,，然后把爬片貼上去,，這樣可以貼的很牢固也沒有氣泡。

6,，常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng),，如果你的細(xì)胞貼壁能力很強(qiáng)，比如用胰酶都要消化3min以上的,，可以不需要第一步,。

二：細(xì)胞固定，通透和染色

這幾個(gè)也是免疫組化的步驟,，就不用解釋了,。直接說流程

1，4%多聚甲醛孵育細(xì)胞10min,?；蛘哂梅旁?20℃預(yù)冷的甲醇孵育5min。這兩個(gè)都是常規(guī)固定液,，非常規(guī)的也有甲醛,，乙醇和丙酮等。

2,，用提前在4℃或者冰上預(yù)冷的PBS洗三次,，不要太用力。

3,，抗原修復(fù),。不要驚訝，就是抗原修復(fù),?；旧虾苌儆腥藭?huì)這么做，但是細(xì)胞免疫熒光里增加了抗原修復(fù)的步驟會(huì)讓抗體更容易染上,，很多做不出來的抗體都可以做出來,。過程就是堿性尿素緩沖液在95℃水浴10min，自然冷卻即可,。

4,，透化。這個(gè)步驟取決于你的抗體針對的是不是胞內(nèi)蛋白,，膜蛋白不需要這個(gè)步驟,。常規(guī)透化劑是0.1% Triton X-100的PBS,。透化10分鐘然后用PBS洗干凈。

5,，封閉,。封閉液可以用溶于PBS的BSA或者二抗物種的血清。BSA的濃度只要1%就可以,，血清只要10%即可,。如果你是用甲醛類做固定液，那么還需要22mg/ml的甘氨酸添加到封閉液里,。如果你的一抗結(jié)合力很強(qiáng)或者二抗有非特異性結(jié)合,，那么添加0.1%吐溫20。

6,，用封閉液稀釋一抗,，4℃過夜孵育。第二天用PBST清洗三遍后避光,。孵育二抗,，二抗?jié)舛却蠹s1抗的十倍。最后染DAPI（1ug/ml）1分鐘,。

7,，PBS洗三遍，用抗淬滅封片劑封片,。邊緣處滴兩滴指甲油,。就可以拍照了。