雄甾烯酮,；雄烯酮（ADT）定量檢測試劑盒（ELISA）

定量檢測血清、血漿,、細胞培養(yǎng)上清液中雄甾烯酮,；雄烯酮（ADT）的濃度。

使用試劑盒前,，必須仔細閱讀本說明書,。

實驗原理

本試劑盒采用競爭法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。在預包被抗雄甾烯酮,；雄烯酮（ADT）抗體（固相抗體）的微孔酶標板中,，加入雄甾烯酮；雄烯酮（ADT）校準品和待測樣本,，再加入HRP標記的雄甾烯酮,；雄烯酮（ADT）抗原（酶標抗原），經(jīng)過溫育與充分洗滌,，去除未結(jié)合的組分,，在微孔板固相表面形成固相抗體-酶標抗原的免疫復合物。加底物A和B,，底物在HRP催化下,，產(chǎn)生藍色產(chǎn)物，在終止液（2M 硫酸）作用下,，最終轉(zhuǎn)化為黃色,，在酶標儀450nm波長上測定吸光度（OD值）,，吸光度（OD值）與待測樣品中雄甾烯酮；雄烯酮（ADT）的濃度負相關,。擬合校準品曲線,，可以計算出樣本中雄甾烯酮；雄烯酮（ADT）的濃度,。

試劑盒限制性

1,、 僅供科研使用，不得用于臨床診斷,。

2,、 在試劑盒標示的有效期內(nèi)使用，過期產(chǎn)品不得使用,。

3,、 跟其他廠家的試劑盒或者組分不能混用。

4,、 使用試劑盒配套的樣品稀釋液,。

5、 如果樣本值高于最高標準品濃度值,，請將樣本適當稀釋后,，再重新測定。

6,、 待測樣本中存在的人抗鼠等異嗜抗體會干擾檢測結(jié)果,，檢測前，請排出該因素,。

7,、 通過其他方法得到的檢測結(jié)果，與本試劑盒測定結(jié)果不具有直接的可比性,。

技術提示

1,、 混合蛋白溶液時，避免起泡,。

2,、 加校準品與樣本時，每個校準品濃度和樣本都要更換移液槍頭,，公共組分應該懸臂加樣,，避免交叉污染。

3,、 合適的溫育時間,，和充分的洗滌步驟，是保證實驗結(jié)果準確性的必要條件,。

4,、 使用自動洗板機時,，加入一個30秒浸泡的步驟，可以提高檢測精度,。

5,、 底物溶液為無色液體，保存過程中變?yōu)樗{色,，代表底物溶液已經(jīng)失效,，不得使用。

6,、 終止液加樣順序與底物溶液加樣順序一致,，加入終止液后，藍色底物產(chǎn)物,，會瞬間變?yōu)辄S色,。

7、 實驗中,，用剩的板條,，應立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存,。

8,、 所有液體組分，使用前充分搖勻,，嚴格按照說明書標明的時間、加樣量及加樣順序進行溫育操作,。

試劑盒組分與保存

未開封的試劑盒保存在2-8度,，不得使用過期試劑盒。

標準品濃度依次為：20,、10,、5、2.5,、1.25,、0 ng/mL.

其他用品

1、 酶標儀（450nm）

2,、 精密移液器及一次性吸頭

3,、 蒸餾水

4、 洗瓶或者自動洗板機

5,、 37℃水浴鍋或恒溫箱

6,、 500ml量筒

生物安全

1、 檢測必須符合實驗室管理規(guī)范的規(guī)定,，嚴格防止交叉污染,，所有樣品,、洗棄液和各種廢棄物都應按照傳染物進行處置。

2,、 試劑盒的液體組分中,，含有proclin-300防腐劑，可能引起皮膚過敏反應,，避免吸入煙霧與皮膚接觸,。

3、 底物液對皮膚,、眼睛和上呼吸道有刺激作用,，避免吸入煙霧。

4,、 戴上防護手套,，實驗完成后徹di洗手。

樣品的采集和儲存

以下只是列出樣品采集和保存的一般指南,。所有樣本采集保存過程中,，不得使用疊氮鈉做為防腐劑。

1,、 細胞培養(yǎng)上清：4000rpm條件下離心20min,，去除細胞顆粒和聚合物，上清液保存在- 20℃以下,，避免反復凍融,。

2、 血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管,，操作過程中避免任何細胞刺激,，4000rpm條件下離心20min，小心地分離出血清,，保存在-20℃以下,，避免反復凍融。

3,、 血漿：肝素,，EDTA，或檸檬酸鈉作為抗凝劑,。在4000rpm條件下,，離心20分鐘取上清，血漿保存在-20℃以下,，避免反復凍融,。

樣本收集后，無法一次檢測完畢,，請按一次用量分裝凍存,，避免反復凍融,，使用時在室溫下解凍，確保樣品均勻充分解凍,。

4,、 組織勻漿：用預冷的PBS (0.01 M,pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液,，稱重后將組織剪碎,。將剪碎的組織與對應體積的PBS(一般按1: 9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應9 mL的PBS,，具體體積可根據(jù)實驗需要適當調(diào)整,，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑)加入玻璃勻漿器中,，在冰上充分研磨,。為了進一步裂解組織細胞，可以對勻漿液進行超聲破碎或反復凍融,。最后將勻漿液5000×g離心 5-10分鐘,，取上清檢測。

5,、 細胞提取液：貼壁細胞用冷的PBS輕輕清洗,，然后用胰蛋白酶消化，1000×g離心5分鐘后收集細胞,；懸浮細 胞可直接離心收集,。收集的細胞用冷的PBS洗滌3次。每 1×106 個細胞中加入150-200μLPBS重懸并通過反復凍融使細胞破碎(若含量很低可減少PBS的體積),。將提取液于1500×g離心10分鐘,，取上清檢測。  

6,、 其他生物體液：1000×g 離心20分鐘，除去雜質(zhì)及細胞碎片,。取上清檢測,。

試劑準備

1、 使用前,，所有的組分都要至少復溫60min,，確保充分復溫到室溫。

2,、 濃縮洗滌液：從冰箱取出的濃縮洗滌液,，會有結(jié)晶產(chǎn)生，這屬于正?，F(xiàn)象,，水浴加熱使結(jié)晶wan全溶解,。濃縮洗滌液與蒸餾水，按1:20稀釋,，即1份的濃縮洗滌液,，添加19份的蒸餾水。

3,、 底物：底物液A和B,，在使用前，按1:1體積充分混合,，混合后15分鐘內(nèi)使用,。

操作程序

所有試劑和組分都先恢復到室溫，標準品,、質(zhì)控品和樣品,，建議做復孔。

1,、 按前面說明書描述的方法,，配制好試劑盒各種組分的工作液。

2,、 從鋁箔袋中取出所需板條,，剩余的板條用自封袋密封放回冰箱。

設置標準品孔,、空白孔和樣本孔,，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL，空白孔不加,，樣本孔加待測樣本50μL,。

3、除空白孔外,，標準品孔和樣本孔,，加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗原100μL。

4,、 用封板膜蓋住反應板,，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

5,、 揭開封板膜,，棄去液體，吸水紙上拍干,，每孔加滿洗滌液,，靜置20S，甩去洗滌液，吸水紙上拍干,，如此重復5次,。若使用自動洗板機，請按洗板機操作程序進行洗板,，添加浸泡30s的程序,，可以提高檢測的精度。洗板結(jié)束,，加底物前,，要在干凈不掉屑的紙上，充分拍干反應板,。

6,、 將底物A和B按1:1體積充分混合，所有孔中加入底物混合液100μL,。用封板膜蓋住反應板,，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育15min。

7,、 所有孔加入終止液50μL,，在酶標儀上讀取各孔吸光度（OD值）。

結(jié)果計算

1,、 以標準品濃度做為橫坐標,，對應的吸光度（OD值）作為縱坐標，利用計算機軟件,，采用四參數(shù)Logistic曲線擬合（4-pl）,，創(chuàng)建標準曲線方程，通過樣本的吸光度（OD值）,，利用方程計算樣品的濃度值,。

2、 如果樣品被稀釋,，通過上述方法測的濃度值,，要乘以稀釋倍數(shù)，才是樣品的最終濃度,。

試劑盒性能指標

1,、物理性能

試劑盒的各液體組分應澄清透明、無沉淀或者絮狀物,。微孔板鋁箔袋應真空包裝，無破損漏氣,。

2,、劑量反應曲線線性

校準品劑量反應曲線相關系數(shù)r值，大于等于0.9900。

3,、精密度

批內(nèi)精密度：三組已知的高,、中、低濃度樣品,，進行二十次在同一個板塊內(nèi)精度評估,。批內(nèi)變異系數(shù)CV%小于10%。

批間精密度：三組已知的高,、中,、低濃度樣品，進行二十次在不同板塊內(nèi)精度評估,。批間變異系數(shù)CV%小于15%,。

4、靈敏度

最di檢出劑量小于0.1 ng/mL,。

5,、回收率

三組已知的高、中,、低濃度樣品,，進行五次在同一個板塊內(nèi)回收率評估，回收率在85%-115%之間,。

6,、特異性

本試劑盒識別天然和重組雄甾烯酮；雄烯酮（ADT）,，與結(jié)構(gòu)類似物無交叉,。

7、穩(wěn)定性

2℃-8℃保存,，有效期6個月,。

8、 檢測范圍

0.625 ng/mL - 20 ng/mL