雄甾烯酮,；雄烯酮（ADT）定量檢測試劑盒（ELISA）

定量檢測血清,、血漿、細胞培養(yǎng)上清液中雄甾烯酮,；雄烯酮（ADT）的濃度,。

使用試劑盒前,，必須仔細閱讀本說明書。

實驗原理

本試劑盒采用競爭法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）,。在預(yù)包被抗雄甾烯酮,；雄烯酮（ADT）抗體（固相抗體）的微孔酶標板中，加入雄甾烯酮,；雄烯酮（ADT）校準品和待測樣本,，再加入HRP標記的雄甾烯酮；雄烯酮（ADT）抗原（酶標抗原）,，經(jīng)過溫育與充分洗滌,，去除未結(jié)合的組分，在微孔板固相表面形成固相抗體-酶標抗原的免疫復(fù)合物,。加底物A和B,，底物在HRP催化下，產(chǎn)生藍色產(chǎn)物,，在終止液（2M 硫酸）作用下,，最終轉(zhuǎn)化為黃色，在酶標儀450nm波長上測定吸光度（OD值）,，吸光度（OD值）與待測樣品中雄甾烯酮,；雄烯酮（ADT）的濃度負相關(guān)。擬合校準品曲線,，可以計算出樣本中雄甾烯酮,；雄烯酮（ADT）的濃度。

試劑盒限制性

1,、 僅供科研使用,，不得用于臨床診斷。

2,、 在試劑盒標示的有效期內(nèi)使用,，過期產(chǎn)品不得使用。

3,、 跟其他廠家的試劑盒或者組分不能混用,。

4、 使用試劑盒配套的樣品稀釋液,。

5,、 如果樣本值高于最高標準品濃度值，請將樣本適當稀釋后,，再重新測定,。

6、 待測樣本中存在的人抗鼠等異嗜抗體會干擾檢測結(jié)果,，檢測前,，請排出該因素,。

7、 通過其他方法得到的檢測結(jié)果,，與本試劑盒測定結(jié)果不具有直接的可比性,。

技術(shù)提示

1、 混合蛋白溶液時,，避免起泡,。

2、 加校準品與樣本時,，每個校準品濃度和樣本都要更換移液槍頭,，公共組分應(yīng)該懸臂加樣，避免交叉污染,。

3,、 合適的溫育時間，和充分的洗滌步驟,，是保證實驗結(jié)果準確性的必要條件,。

4、 使用自動洗板機時,，加入一個30秒浸泡的步驟,，可以提高檢測精度。

5,、 底物溶液為無色液體,，保存過程中變?yōu)樗{色，代表底物溶液已經(jīng)失效,，不得使用,。

6、 終止液加樣順序與底物溶液加樣順序一致,，加入終止液后,，藍色底物產(chǎn)物，會瞬間變?yōu)辄S色,。

7,、 實驗中,，用剩的板條,，應(yīng)立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存,。

8,、 所有液體組分，使用前充分搖勻,，嚴格按照說明書標明的時間,、加樣量及加樣順序進行溫育操作,。

試劑盒組分與保存

未開封的試劑盒保存在2-8度，不得使用過期試劑盒,。

標準品濃度依次為：20,、10、5,、2.5,、1.25、0 ng/mL.

其他用品

1,、 酶標儀（450nm）

2,、 精密移液器及一次性吸頭

3、 蒸餾水

4,、 洗瓶或者自動洗板機

5,、 37℃水浴鍋或恒溫箱

6、 500ml量筒

生物安全

1,、 檢測必須符合實驗室管理規(guī)范的規(guī)定,，嚴格防止交叉污染，所有樣品,、洗棄液和各種廢棄物都應(yīng)按照傳染物進行處置,。

2、 試劑盒的液體組分中,，含有proclin-300防腐劑,，可能引起皮膚過敏反應(yīng)，避免吸入煙霧與皮膚接觸,。

3,、 底物液對皮膚、眼睛和上呼吸道有刺激作用,，避免吸入煙霧,。

4、 戴上防護手套,，實驗完成后徹di洗手,。

樣品的采集和儲存

以下只是列出樣品采集和保存的一般指南。所有樣本采集保存過程中,，不得使用疊氮鈉做為防腐劑,。

1、 細胞培養(yǎng)上清：4000rpm條件下離心20min,，去除細胞顆粒和聚合物,，上清液保存在- 20℃以下，避免反復(fù)凍融,。

2,、 血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管,，操作過程中避免任何細胞刺激，4000rpm條件下離心20min,，小心地分離出血清,，保存在-20℃以下，避免反復(fù)凍融,。

3,、 血漿：肝素，EDTA,，或檸檬酸鈉作為抗凝劑,。在4000rpm條件下，離心20分鐘取上清,，血漿保存在-20℃以下,，避免反復(fù)凍融。

樣本收集后,，無法一次檢測完畢,，請按一次用量分裝凍存，避免反復(fù)凍融,，使用時在室溫下解凍,，確保樣品均勻充分解凍,。

4,、 組織勻漿：用預(yù)冷的PBS (0.01 M,pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液,，稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應(yīng)體積的PBS(一般按1: 9的重量體積比,，比如1g的組織樣品對應(yīng)9 mL的PBS,，具體體積可根據(jù)實驗需要適當調(diào)整,，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑)加入玻璃勻漿器中,，在冰上充分研磨。為了進一步裂解組織細胞，可以對勻漿液進行超聲破碎或反復(fù)凍融,。最后將勻漿液5000×g離心 5-10分鐘，取上清檢測,。

5,、 細胞提取液：貼壁細胞用冷的PBS輕輕清洗,，然后用胰蛋白酶消化,，1000×g離心5分鐘后收集細胞,；懸浮細 胞可直接離心收集,。收集的細胞用冷的PBS洗滌3次,。每 1×106 個細胞中加入150-200μLPBS重懸并通過反復(fù)凍融使細胞破碎(若含量很低可減少PBS的體積),。將提取液于1500×g離心10分鐘,，取上清檢測。  

6,、 其他生物體液：1000×g 離心20分鐘,，除去雜質(zhì)及細胞碎片,。取上清檢測。

試劑準備

1,、 使用前，所有的組分都要至少復(fù)溫60min,，確保充分復(fù)溫到室溫,。

2,、 濃縮洗滌液：從冰箱取出的濃縮洗滌液,，會有結(jié)晶產(chǎn)生，這屬于正?，F(xiàn)象,，水浴加熱使結(jié)晶wan全溶解。濃縮洗滌液與蒸餾水,，按1:20稀釋,，即1份的濃縮洗滌液，添加19份的蒸餾水,。

3,、 底物：底物液A和B，在使用前,，按1:1體積充分混合,，混合后15分鐘內(nèi)使用,。

操作程序

所有試劑和組分都先恢復(fù)到室溫，標準品,、質(zhì)控品和樣品,，建議做復(fù)孔。

1,、 按前面說明書描述的方法，配制好試劑盒各種組分的工作液,。

2、 從鋁箔袋中取出所需板條,，剩余的板條用自封袋密封放回冰箱,。

設(shè)置標準品孔,、空白孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL,，空白孔不加,，樣本孔加待測樣本50μL,。

3,、除空白孔外,，標準品孔和樣本孔，加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗原100μL,。

4,、 用封板膜蓋住反應(yīng)板，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min,。

5,、 揭開封板膜,，棄去液體，吸水紙上拍干,，每孔加滿洗滌液,，靜置20S,，甩去洗滌液,，吸水紙上拍干,，如此重復(fù)5次,。若使用自動洗板機,，請按洗板機操作程序進行洗板,，添加浸泡30s的程序,，可以提高檢測的精度,。洗板結(jié)束,，加底物前,，要在干凈不掉屑的紙上,，充分拍干反應(yīng)板。

6,、 將底物A和B按1:1體積充分混合，所有孔中加入底物混合液100μL,。用封板膜蓋住反應(yīng)板,，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育15min,。

7、 所有孔加入終止液50μL,，在酶標儀上讀取各孔吸光度（OD值）,。

結(jié)果計算

1,、 以標準品濃度做為橫坐標,，對應(yīng)的吸光度（OD值）作為縱坐標,，利用計算機軟件,，采用四參數(shù)Logistic曲線擬合（4-pl）,，創(chuàng)建標準曲線方程,，通過樣本的吸光度（OD值）,，利用方程計算樣品的濃度值,。

2、 如果樣品被稀釋,，通過上述方法測的濃度值,，要乘以稀釋倍數(shù),，才是樣品的最終濃度。

試劑盒性能指標

1,、物理性能

試劑盒的各液體組分應(yīng)澄清透明,、無沉淀或者絮狀物。微孔板鋁箔袋應(yīng)真空包裝,，無破損漏氣,。

2、劑量反應(yīng)曲線線性

校準品劑量反應(yīng)曲線相關(guān)系數(shù)r值,，大于等于0.9900,。

3、精密度

批內(nèi)精密度：三組已知的高,、中,、低濃度樣品，進行二十次在同一個板塊內(nèi)精度評估,。批內(nèi)變異系數(shù)CV%小于10%,。

批間精密度：三組已知的高、中,、低濃度樣品,，進行二十次在不同板塊內(nèi)精度評估,。批間變異系數(shù)CV%小于15%,。

4、靈敏度

最di檢出劑量小于0.1 ng/mL,。

5,、回收率

三組已知的高、中,、低濃度樣品,，進行五次在同一個板塊內(nèi)回收率評估，回收率在85%-115%之間,。

6,、特異性

本試劑盒識別天然和重組雄甾烯酮；雄烯酮（ADT）,，與結(jié)構(gòu)類似物無交叉,。

7、穩(wěn)定性

2℃-8℃保存,，有效期6個月,。

8、 檢測范圍

0.625 ng/mL - 20 ng/mL