TaqMan One Step RT-qPCR Kit

產(chǎn)品貨號：T11239

產(chǎn)品規(guī)格：50T/200T

產(chǎn)品介紹:

TaqMan One Step RT-qPCR kit （qRT-PCR Probe）是一步法（One Step）RT-PCR熒光定量探針法定性,、定量反應(yīng)的專用試劑，反應(yīng)過程在同一管內(nèi)連續(xù)進(jìn)行，避免開管,，能有效防止污染,。本品含有高溫反轉(zhuǎn)錄酶（RNase H-）和新型熱啟動酶,，具有更高的反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增效率,，適合于低濃度RNA模板的高靈敏度擴(kuò)增。本試劑采用優(yōu)化配方的專用Buffer,，可以在較寬的定量區(qū)域內(nèi)得到良好的標(biāo)準(zhǔn)曲線,，準(zhǔn)確進(jìn)行定量，并與多數(shù)廠家的熒光定量PCR 儀兼容,，如Applied Biosystems,、 Eppendorf、Bio-Rad和Roche等,。

試劑組成：

25×One Step RT-qPCR RTase mix

5×One Step RT-qPCR Buffer

10×Enhancer

試劑原理： 

TaqMan One Step RT-qPCR kit首先利用反轉(zhuǎn)錄酶RTase將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,，再以cDNA為模板通過熱啟動DNA擴(kuò)增酶在單管閉管反應(yīng)體系中連續(xù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，利用熒光標(biāo)記探針（Probe）水解發(fā)光,，并對發(fā)光信號進(jìn)行檢測,。

1. RT-PCR

首先采用反轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成cDNA,，然后再以合成的cDNA為模板,，經(jīng)過PCR擴(kuò)增反應(yīng)的熱變性、引物退火,、鏈延伸三個步驟循環(huán)往復(fù),，在短時間內(nèi)擴(kuò)增得到大量DNA片段。

2. 熒光檢出

TaqMan探針法是使用5’端帶有熒光物質(zhì),，3’端帶有淬滅物質(zhì)的TaqMan探針進(jìn)行熒光檢測的方法,。在探針沒有被 Taq酶分解時，5’端的熒光物質(zhì)受到3’端淬滅物質(zhì)的制約,，不能發(fā)出熒光,。而當(dāng)TaqMan探針被分解后，5’端的熒光物質(zhì)便會游離出來,，發(fā)出熒光,。在PCR反應(yīng)液中加入熒光探針后的退火過程中，熒光探針便會和模板配對區(qū)域結(jié)合,。在PCR反應(yīng)的延伸過程中,，Taq DNA聚合酶的5’→3’ 核酸外切酶活性可以分解和模板雜交的熒光探針，游離出的熒光物質(zhì)便會發(fā)出熒光,。通過檢測反應(yīng)體系中的熒光強(qiáng)度,，可以達(dá)到檢測PCR產(chǎn)物擴(kuò)增量的目的,。

反應(yīng)條件： 

1. PCR 程序（兩步法）

反轉(zhuǎn)錄：50℃ 20分鐘；

變  性：95℃ 3分鐘,；

變  性：95℃ 10~20秒,；

退火/延伸：60℃ 20~60秒

2. PCR 程序（三步法）

反轉(zhuǎn)錄：50℃ 20分鐘；

變  性：95℃ 3分鐘,；

變  性：95℃ 10~20秒,；

退  火：56-64℃ 10~30秒；

延  伸：72℃ 10~60秒,。

RT-PCR 反應(yīng)體系配制

1. 通常引物終濃度為0.2µM可以得到較好結(jié)果,。反應(yīng)性能較差時，可以在0.1～1.0µM范圍內(nèi)調(diào)整引物濃度,；

2. 通常探針濃度可在0.1～0.3µM范圍內(nèi)優(yōu)化,。可進(jìn)行濃度梯度的實(shí)驗(yàn),，尋找引物和探針的最佳組合,。探針的使用與 Real Time PCR擴(kuò)增儀、探針種類,、熒光標(biāo)記物質(zhì)種類有關(guān),，請參照儀器說明書或各熒光探針的具體使用要求進(jìn)行；

3. 不同種類的模板中含有的靶基因的拷貝數(shù)不同,，必要時可進(jìn)行梯度稀釋,，確定最佳的模板添加量。

質(zhì)量控制： 

1. 功能檢測：qPCR的敏感性,、特異性,、可重復(fù)性；

2. 無外源核酸酶活性,，無外源內(nèi)切,、外切核酸酶污染。

技術(shù)說明： 

1. 該體系常用50℃進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng),，可以在45℃~60℃范圍內(nèi)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄溫度優(yōu)化,；根據(jù)反應(yīng)特征不同，可以在5~30分鐘內(nèi)對反轉(zhuǎn)錄時間進(jìn)行優(yōu)化,；

2. 該體系所用的反轉(zhuǎn)錄酶是在MMLV基礎(chǔ)上進(jìn)行了基因改造,，去除了RNaseH活性，使其具有更高的溫度耐受性和反轉(zhuǎn)錄溫度,，對RNA復(fù)雜結(jié)構(gòu)模板具有更高的反轉(zhuǎn)錄效率,；

3. 該體系具有更好的體系穩(wěn)定性和適用性，非常適合于病毒類,、組織提取RNA復(fù)雜模板的檢測,；對極限濃度模板的擴(kuò)增效果更加穩(wěn)定,。

保存：

-20℃保存長期保存，使用前應(yīng)混勻,，避免反復(fù)凍融,。