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Co-IP 實驗不踩坑：蛋白 “拉下場“ 的秘密,！揭秘Co-IP實驗操作技巧

來源：MedChemExpress LLC 2024年12月26日 10:23

在蛋白生物學的世界里，Co-IP 是解鎖蛋白質“朋友圈”的神兵利器,。但如果操作不當,，它可能會變成實驗室里的“尷尬社交”。今天,，我們就來聊聊如何讓你的 Co-IP 實驗優(yōu)雅又高效,，輕松把蛋白“拉下場”！

什么是 Co-IP,？

免疫共沉淀 (Co-Inmunoprecipitation, Co-IP) 是一種利用目標蛋白特異性抗體與蛋白 A/G 磁珠或瓊脂糖珠結合，從而沉淀目標蛋白及其相互作用蛋白的技術 ^[1-4],。

Co-IP 實驗不踩坑：蛋白 “拉下場“ 的秘密,！揭秘Co-IP實驗操作技巧

圖 1. Co-IP 原理圖。

X：誘餌蛋白,，Z：靶標蛋白

簡單來說,，就是利用抗體捕捉目標蛋白，看看有哪些其他蛋白會“搭順風車”來到沉淀派對,。這樣我們就可以知道哪些蛋白質在細胞內是好朋友,，經常一起 Hang out！

Co-IP 優(yōu)勢

可沉淀誘餌蛋白在天然組織細胞狀態(tài)下存在互作關系的所有蛋白,；

可沉淀整個復合體中直接/間接互作的多個蛋白,，研究復合體組成；

可與質譜鑒定連用可以初篩到一系列未知蛋白,，再通過其他技術進一步驗證,；

分離得到天然狀態(tài)下相互作用的蛋白質復合體，結果更真實可靠,。

Co-IP 分類

根據抗體來源,、靶蛋白表達方式及樣本類型等差異，Co-IP 可分為單克隆抗體/多克隆抗體 Co-IP,、內源性/外源性 Co-IP,、探索型/驗證型 Co-IP 等類型。

在眾多 Co-IP 分類方式中,，內源性和外源性 Co-IP 就像科研界的雙子星,，不僅最-常用,，還各自閃耀獨-特的光芒！

小貼士：

內源性 Co-IP：研究細胞或組織中自然表達的蛋白質,。

外源性 Co-IP：研究經過轉染介導的外源表達系統(tǒng)來表達的蛋白質,。

操作步驟與結果分析

Co-IP 實驗流程

Co-IP 實驗不踩坑：蛋白 “拉下場“ 的秘密！揭秘Co-IP實驗操作技巧

圖 2. Co-IP 實驗流程圖^[1][5],。

Co-IP 流程 (以內源性 Co-IP 為例)^[1]

樣本準備

采用適當的方法收集細胞,，使用含有合適的蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液裂解細胞。

固相介質準備

將含有保護液的蛋白 A/G 磁珠或蛋白 A/G 瓊脂糖混勻取出,，用平衡液清洗磁珠/瓊脂糖凝膠,。

預清洗 (可選)

將細胞裂解液或已預處理的樣本用蛋白 A/G 磁珠或蛋白 A/G 瓊脂糖進行預清洗，去除非特異性結合的蛋白質,。

免疫沉淀

預清洗的樣本中加入誘餌蛋白的特異性抗體,，孵育促進抗體與蛋白結合。加入蛋白 A/G 磁珠或蛋白 A/G 瓊脂糖繼續(xù)孵育使其與復合物結合,。

洗滌

洗滌復合物,，去除非特異性結合蛋白。

洗脫

加入洗脫緩沖液,，洗脫,。

分析

Western Blot 或質譜檢測分析沉淀的誘餌蛋白及與其結合的靶標蛋白。

小貼士：

內源性 Co-IP 實驗可選擇蛋白 A/G 磁珠或蛋白 A/G 瓊脂糖,；外源性 Co-IP 實驗中蛋白攜帶標簽 (如 Flag,、HA、c-Myc,、GST 等),，可以選擇標簽抗體類磁珠/瓊脂糖凝膠珠 (如 Anti-Flag 磁珠、Anti-HA 磁珠,、Anti-c-Myc 磁珠,、Anti-GST 磁珠等)，可一定程度增強豐度,，減少 IgG 干擾,。

Co-IP 結果解讀

隨著 Co-IP 實驗流程的完成，我們終于手握初步數據,！那么,，這些數據能告訴我們什么秘密？結果出來了,，腫么分析呢,？

以下讓小 M 通過兩個經典案例，來看看如何解讀實驗結果，挖掘蛋白質相互作用的“朋友圈”,！

內源性 Co-IP 結果解讀

圖 3. 內源性 ANT2 和 GRP75之間存在相互作用^[6],。

外源性 Co-IP 結果解讀

圖 4. 外源 GRP75 可增強 ANT2-UCP1 的相互作用^[6]。

避坑指南：如何高效無誤地進行 Co-IP?

樣品準備：打好地基

拉蛋白就是請客吃飯,，不給它們舒適的環(huán)境,，誰都不愿來！

關注點	說明
裂解液	溫和的非離子型洗滌劑 (如 NP-40,、Triton X-100) 可以保護蛋白的天然結構,，同時避免過強的去污劑 (如 SDS) 破壞蛋白相互作用。 MCE 裂解液推薦：WB/IP 裂解液,、NP-40 裂解液,、哺乳動物活性蛋白抽提試劑。
鹽濃度	樣品準備時體系中的鹽濃度范圍在 150 - 300 mM 即可,，過高可能“拆散”蛋白關系，過低可能導致背景蛋白“攪局”,。
蛋白酶抑制劑	適當加入蛋白酶抑制劑,，保護“核心成員”防止其被細胞內源性蛋白酶降解。 MCE 蛋白酶抑制劑推薦：蛋白酶抑制劑 Cocktail,、蛋白酶抑制劑 Cocktail, 片劑,。
結構干擾	提前查閱文獻了解蛋白“愛好”，重視蛋白修飾,，如磷酸化,、乙酰化等是否會影響復合物的穩(wěn)定性,。
表達水平	提前驗證目標蛋白表達水平,，表達低可考慮優(yōu)化轉染或表達條件。
溫度	低溫環(huán)境下制備樣品,，防止蛋白“跑路”,。

抗體選擇：定向輸出

抗體選不好，后果你懂的……

無論是拉下目標蛋白還是背景干擾,，抗體都能“一錘定音”,。

關注點	說明
抗體專一性	選擇經過 IP 驗證的抗體，不可盲選,。 MCE 標簽抗體：DYKDDDDK Tag (FLAG) 抗體,、HA tag 抗體 (YA856)、Myc-tag 抗體,。
同型對照	根據 IP 抗體類型選擇合適的同型對照抗體,。 MCE 同型對照抗體推薦：Rabbit IgG Isotype Control、Mouse IgG Isotype Control。
抗體來源	一抗和二抗的宿主種屬要避開“同宗”,，否則背景會搶戲,。
抗體測試	必要時進行預實驗封閉抗體測試，驗證磁珠/瓊脂糖珠可與抗體有效結合,。
抗體用量	太多可能造成非特異性沉淀,，太少又可能拉不住目標蛋白。建議從優(yōu)化實驗中找到合適的濃度和用量,。
二抗選擇	如果抗體重鏈和目標蛋白大小相近,，可選擇輕鏈特異性二抗避免“撞車”。

實驗設計：精準操作

Co-IP 實驗不止“拉下”,，其他環(huán)節(jié)也是“硬仗”,。

實驗環(huán)節(jié)	說明
實驗設計	確定研究的蛋白質對，不胡亂邀請“不相干”的蛋白,。
對照組設計	實驗組,、IgG 陰性組、陽性組 (Input),。
洗滌條件	適當調整洗滌強度 (如低鹽到高鹽,、去垢劑濃度等)，既要去除非特異性蛋白,，又要保護靶蛋白復合物,。
Western Blot	用 Western Blot來做最后的“身份確認”，確保邀請到的都是真正的“貴賓”,。

經典問題和解決方案

如何讓你的 Co-IP 實驗更上一層樓,？

每次實驗的具體條件、操作步驟記得詳細記錄,，這樣才能在出現(xiàn)問題時找到原因,，不斷優(yōu)化喔~

Co-IP 實驗不踩坑：蛋白 “拉下場“ 的秘密！揭秘Co-IP實驗操作技巧

Co-IP 實驗不踩坑：蛋白 “拉下場“ 的秘密,！揭秘Co-IP實驗操作技巧

Co-IP 實驗不踩坑：蛋白 “拉下場“ 的秘密！揭秘Co-IP實驗操作技巧

小結

每一個 Co-IP 實驗都是一場精彩的游戲,，我們不僅是執(zhí)行者,，更是策略家。這就是科研人的浪漫——在實驗中找尋未知的興奮,，用結果揭示生命的奧秘,。

如果你覺得這篇干貨滿滿的 Co-IP 秘籍有幫助，別忘了點贊,、分享哦,！期待在評論區(qū)看到你們的精彩討論和寶貴經驗,！我們下期再見，繼續(xù)解鎖更多實驗技巧,，讓科研不再有坑,，只有驚喜！

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Rabbit IgG Isotype Control (HY-P80879)

兔 IgG 陰性對照

Mouse IgG Isotype Control (HY-P80757)

鼠 IgG 陰性對照

[1] Lin JS, et al. Protein-Protein Interactions: Co-Immunoprecipitation. Methods Mol Biol. 2017;1615:211-219.

[2] Tan L, Yammani RR. Co-Immunoprecipitation-Blotting: Analysis of Protein-Protein Interactions. Methods Mol Biol. 2022;2413:145-154.

[3] Lee C. Coimmunoprecipitation assay. Methods Mol Biol. 2007;362:401-6.

[4] Tang Z, et al. Analysis of Protein-Protein Interaction by Co-IP in Human Cells. Methods Mol Biol. 2018;1794:289-296.

[5] Burckhardt CJ, Minna JD, Danuser G. Co-immunoprecipitation and semi-quantitative immunoblotting for the analysis of protein-protein interactions. STAR Protoc. 2021 Jul 6;2(3):100644.

[6] Chen X, et al. GRP75 triggers white adipose tissue browning to promote cancer-associated cachexia. Signal Transduct Target Ther. 2024 Sep 26;9(1):253.

參考文獻：

[1] Lin JS, et al. Protein-Protein Interactions: Co-Immunoprecipitation. Methods Mol Biol. 2017;1615:211-219.

[2] Tan L, Yammani RR. Co-Immunoprecipitation-Blotting: Analysis of Protein-Protein Interactions. Methods Mol Biol. 2022;2413:145-154.

[3] Lee C. Coimmunoprecipitation assay. Methods Mol Biol. 2007;362:401-6.

[4] Tang Z, et al. Analysis of Protein-Protein Interaction by Co-IP in Human Cells. Methods Mol Biol. 2018;1794:289-296.

[5] Burckhardt CJ, Minna JD, Danuser G. Co-immunoprecipitation and semi-quantitative immunoblotting for the analysis of protein-protein interactions. STAR Protoc. 2021 Jul 6;2(3):100644.

[6] Chen X, et al. GRP75 triggers white adipose tissue browning to promote cancer-associated cachexia. Signal Transduct Target Ther. 2024 Sep 26;9(1):253.

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