藥物代謝酶CYP450代謝表型研究體外評(píng)估模型解析
經(jīng)藥物代謝酶CYP450 IC50抑制體外評(píng)估模型解析一文,我們明確了國(guó)家藥監(jiān)局藥審中心發(fā)布的《藥物相互作用研究技術(shù)指導(dǎo)原則(試行)》[1]及國(guó)際人用藥品注冊(cè)技術(shù)協(xié)調(diào)理事會(huì)(ICH)發(fā)布的《M12:藥物相互作用》[2]指導(dǎo)原則對(duì)于藥物-藥物相互作用(DDI)研究的目標(biāo)和方向,,即代謝酶介導(dǎo)的藥物相互作用聚焦在底物/酶表型,、抑制劑及誘導(dǎo)劑三個(gè)方面,。經(jīng)過(guò)可逆性IC50抑制作用體外模型評(píng)估,本篇文章將從藥物體外代謝細(xì)胞色素P450(Cytochrome P450, CYP酶)的反應(yīng)表型研究方面進(jìn)行闡述,。
Keywords: CYP450, Cytochrome P450, Enzyme metabolism phenotype, DDI
一、藥物CYP450酶表型代謝研究
藥物代謝鑒定研究,,通常被稱為反應(yīng)表型研究,,用于確定有助于藥物主要消除途徑的代謝酶的類型、數(shù)量和相對(duì)貢獻(xiàn)率,。根據(jù)指導(dǎo)原則可知位于肝臟細(xì)胞滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的細(xì)胞色素P450(Cytochrome P450,,CYP)酶系催化的藥物代謝是人體內(nèi)主要的藥物代謝方式之一,因此,,在人體試驗(yàn)前開(kāi)展合理的體外代謝試驗(yàn)評(píng)估CYP450酶與在研藥物之間的關(guān)系極為重要,!
如果藥物主要通過(guò)單一的代謝途徑對(duì)藥物進(jìn)行清除,可能會(huì)存在很大的用藥風(fēng)險(xiǎn),;反之,,如果某一藥物的代謝過(guò)程涉及的代謝酶越多,則說(shuō)明其代謝途徑也越多,,也就難以發(fā)生潛在的藥物-藥物相互作用,,使得患者之間的治療偏差降低。如下圖所示:以西尼地平為例,,IPHASE采用肝微粒體體外溫孵技術(shù),,研究西尼地平與幾種臨床常用藥物間的代謝相互作用的實(shí)例,結(jié)果表明環(huán)孢素,、紅霉素和辛伐他丁在體外表現(xiàn)出對(duì)西尼地平代謝的抑制作用,,由于三者均是CYP3A的抑制劑或底物,這提示西尼地平與CYP3A的抑制劑或底物合用時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)代謝上的相互作用,,使西尼地平的代謝速率降低,,西尼地平二氫吡啶環(huán)脫氫代謝物生成減少,而原型藥物的水平顯著提高,,這可能會(huì)影響臨床療效的正常發(fā)揮,。
綜上所述,如果合用的藥物具有潛在的抑制或誘導(dǎo)代謝酶的能力,,則前者將受到合用藥物的影響,,從而使其代謝清除途徑發(fā)生量化的改變,這種藥物相互作用可能會(huì)影響治療效果,,增加藥物的治療失敗率,,甚至誘發(fā)不良反應(yīng)。因此,,通過(guò)對(duì)代謝酶表型的體外研究來(lái)判定該化合物的主要代謝酶亞型,,已成為藥物臨床前代謝研究工作中不可少的一部分,。
二、藥物CYP450酶表型代謝研究方法
據(jù)《藥物相互作用研究技術(shù)指導(dǎo)原則《(試行)》和《M12:藥物相互作用》指出:如果物質(zhì)平衡研究表明代謝是藥物的重要消除機(jī)制,,基于物質(zhì)平衡研究估計(jì)貢獻(xiàn)≥25%藥物消除的代謝途徑涉及的代謝酶通常應(yīng)被鑒定,。這適用于CYP酶和非CYP酶。于前者而言,,最常研究的是CYP1A2,、CYP2B6、CYP2C8,、CYP2C9,、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4這7種酶亞型,。
多種源自人體肝臟的體外系統(tǒng)可用于考察藥物潛在的藥物相互作用,。
亞細(xì)胞的人肝組織組分,如微粒體系統(tǒng),,肝組織勻漿 9000 g離心后的上清液(S9)和胞漿(必要時(shí)加入合適輔因子),,建議使用至少有10個(gè)供體的混合人肝微粒體(Human Liver Microsomes, HLM);
源于多種表達(dá)系統(tǒng)的重組CYP酶或非CYP酶,,可用于考察單一藥物代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生和特定同工酶的參與,;
人肝細(xì)胞,包括新鮮制備的肝細(xì)胞和冷凍保存(Cryopreserved)的肝細(xì)胞,,它們可保存細(xì)胞及酶結(jié)構(gòu)并包含完整的I相和II相藥物代謝酶,。
其中進(jìn)行CYP450的酶表型鑒定主要使用選擇性抑制劑、重組人源CYP450 同工酶法及相關(guān)性分析法這3種方法,。選擇性抑制法又分為化學(xué)抑制法和抗體抑制法,,即在加入和不加入一系類CYP450酶亞型選擇性化學(xué)抑制劑或抗體的條件下,分別測(cè)定人肝微粒體對(duì)藥物的代謝活性,,以考察人肝微粒體中CYP450酶亞型倍選擇性抑制后,,藥物的代謝是否受到影響,從而計(jì)算相對(duì)抑制百分率,,推斷CYP450酶代謝表型,。其中,化學(xué)抑制法由于其操作簡(jiǎn)單,,且價(jià)格低廉而得到廣泛應(yīng)用,。
三、藥物代謝酶CYP450代謝表型數(shù)據(jù)分析
鑒于此,,IPHASE以肝微粒體為孵育體系,,輔以NADPH再生系統(tǒng),采用化學(xué)抑制法,,分別以終濃度為1 μM α-萘黃酮,、100 μM 毛果蕓香堿,、50 μM 噻氯匹定、10 μM 奎尼丁,、100 μM 二乙基二硫代氨基甲酸鈉,、1 μM 酮康唑及20μM 磺胺苯吡唑作為CYP 1A2、CYP 2A6,、CYP 2C19,、CYP2D6、CYP 2E1,、CYP 3A4及CYP 2C9等7種亞型酶的特異性選擇性抑制劑,以不含抑制劑的情況為空白對(duì)照,,測(cè)定某一藥物在大鼠,、小鼠和人肝微粒體中的主要代謝酶亞型,孵育時(shí)長(zhǎng)為0min和30min,并采用LC-MS/MS進(jìn)行原型藥物濃度的檢測(cè),。抑制率%=(1- 加入抑制劑樣品代謝速率/空白對(duì)照樣品代謝速率)×100%,。
以下結(jié)果為結(jié)合真實(shí)案例的模擬數(shù)據(jù),以便與大家共同學(xué)習(xí)成長(zhǎng),。
圖1. 大鼠肝微粒中某藥物的代謝抑制率
圖2. 犬肝微粒中某藥物的代謝抑制率
圖3. 人肝微粒中某藥物的代謝抑制率
由上圖可知,,不同種屬微粒體中,該候選藥物的代謝抑制率存在明顯差異,,即在大鼠中,,是CYP2C19為主要代謝酶亞型,而在人中則是CYP1A2,,且大鼠和人微粒體的代謝抑制率都表示出了多種酶亞型對(duì)某藥物的協(xié)同代謝,;相比之下,犬微粒體對(duì)該種藥物的代謝僅有3個(gè)酶的共同作用,,且代謝整體較前兩者而言漸緩,。因此,不同種屬微粒體中參與藥物代謝的酶亞型可能不同,,這便于更好理解藥物的開(kāi)發(fā)及應(yīng)用方向,。
除化學(xué)抑制法外,IPHASE以HEK293為載體,,構(gòu)建人源重組蛋白CYP1A2,,以相同藥物進(jìn)行酶代謝表型試驗(yàn)驗(yàn)證。期間,,重組CYP1A2終濃度為0.2mg/ml,,藥物終濃度為1uM,輔以NADPH再生系統(tǒng),,采用底物消除法,,驗(yàn)證0min,,5min,10min及15min時(shí)間下的代謝情況,,結(jié)果如下圖所示,。
綜上所述,我們可觀察到使用IPHASE 重組酶CYP1A2同該藥物進(jìn)行孵育后,,該藥物具有明顯代謝,,說(shuō)明CYP1A2是該種藥物的主要代謝酶亞型之一,符合化學(xué)抑制法的驗(yàn)證結(jié)果,。因此,,無(wú)論是化學(xué)抑制法還是重組酶法,都可以確認(rèn)藥物CYP450酶的代謝表型,,且兩者相輔相成,,可互相支撐。
然而,,試驗(yàn)總是伴隨著不同的結(jié)果,,不同的試驗(yàn)體系也可能出現(xiàn)不同的結(jié)果。因此,,IPHASE/匯智和源結(jié)合過(guò)去的項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn),,整理并總結(jié)了常見(jiàn)的問(wèn)題及分析結(jié)果,同大家一同學(xué)習(xí)成長(zhǎng),!
1,、化學(xué)抑制法和重組酶法結(jié)果不一致時(shí)該如何解釋?
答:這兩種代謝系統(tǒng)出現(xiàn)的任何差異都不應(yīng)該叫不一致,,而是代謝系統(tǒng)自身的差異導(dǎo)致的正?,F(xiàn)象。肝微粒體是直接提取的肝臟的組分,,是一種同源的代謝系統(tǒng),,而重組酶是通過(guò)蛋白表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出來(lái)的,是一種非同源的測(cè)試系統(tǒng),,所以結(jié)論中以化學(xué)抑制法的結(jié)果為主,,重組酶法的結(jié)果為輔。
2,、是否必須采用化學(xué)抑制法和重組酶法兩種方法試驗(yàn),?
答:代謝表型研究是定性研究,目前的法規(guī)和行業(yè)觀點(diǎn)都認(rèn)為單一方法無(wú)法得出足夠可靠的結(jié)論,,需兩種方法結(jié)合起來(lái)做結(jié)論,。但一般也認(rèn)為,結(jié)論中以化學(xué)抑制法的結(jié)果為主,重組酶法的結(jié)果為輔,。
3,、什么情況下需要考慮進(jìn)行UGT表型研究?
答:在有證據(jù)表明UGT是主要代謝酶的情況下需要考慮進(jìn)行UGT表型研究,;UGT表型研究只采用重組酶法來(lái)進(jìn)行,,并無(wú)UGT亞型特異性抑制劑可采用,但需要注意的是,,CYP和UGT甚至包括其他的代謝酶,,都可能同時(shí)是主要的代謝途徑。
IPHASE相關(guān)產(chǎn)品
鑒于此,,IPHASE作為體外研究生物試劑引-領(lǐng)者,,以肝微粒體為孵育體系,輔以NADPH再生系統(tǒng),、0.1M PBS緩沖液及CYP1A2,、CYP2B6、CYP2C19,、CYP2D6、CYP2C8,、CYP3A4和CYP2C9的特異性抑制劑,,開(kāi)發(fā)了化學(xué)抑制法CYP450 酶代謝表型研究試劑盒,最后通過(guò)底物消除法確認(rèn)結(jié)果,。此外,,為了方便客戶的驗(yàn)證,IPHASE也以HEK293為細(xì)胞載體,,自研構(gòu)建多種CYP重組酶,,為客戶提供多種選擇!
貨號(hào) | 名稱 | 規(guī)格 |
0113A1.11 | IPHASE CYP450 Metabolic Phenotype Research Kit,7 inhibitor, Human Liver Microsomes, Male | 0.2mL*100 test |
0113A1.12 | IPHASE CYP450 Metabolic Phenotype Research Kit,7 inhibitor, Human Liver Microsomes, Female | 0.2mL*100 test |
0113A1.13 | IPHASE CYP450 Metabolic Phenotype Research Kit,7 inhibitor, Human Liver Microsomes, Mixed Gender | 0.2mL*100 test |
0161A1.01 | IPHASE Human CYP1A2+reductase | 0.5mL,0.5nmoL |
0161A1.02 | IPHASE Human CYP2A6+reductase | 0.5mL,0.5nmoL |
0161A1.03 | IPHASE Human CYP2B6+reductase | 0.5mL,0.5nmoL |
0161A1.04 | IPHASE Human CYP2C8+reductase | 0.5mL,0.5nmoL |
0161A2.04 | IPHASE Human CYP2C8+reductase+b5 | 0.5mL,0.5nmoL |
0161A1.05 | IPHASE Human CYP2C9+reductase | 0.5mL,0.5nmoL |
0161A2.05 | IPHASE Human CYP2C9+reductase+b5 | 0.5mL,0.5nmoL |
0161A1.06 | IPHASE Human CYP2C19+reductase | 0.5mL,0.5nmoL |
0161A1.07 | IPHASE Human CYP2D6+reductase | 0.5mL,0.5nmoL |
0161A1.08 | IPHASE Human CYP2E1+reductase | 0.5mL,0.5nmoL |
0161A1.09 | IPHASE Human CYP3A4+reductase | 0.5mL,0.5nmoL |
0161A1.10 | IPHASE Human CYP1A1+reductase | 0.5mL,0.5nmoL |
0161A1.11 | IPHASE Human CYP3A5+reductase | 0.5mL,0.5nmoL |
IPHASE/匯智和源憑借多年的研發(fā)經(jīng)驗(yàn),,推出了多領(lǐng)域,、多種類的高-端科研試劑,為藥物早期研發(fā)提供篩選工具,,為生命科學(xué)領(lǐng)域的探索提供新材料,、新方法和新手段,為遺傳毒性研究提供便捷產(chǎn)品,。此外,,IPHASE/匯智和源可提供特殊產(chǎn)品的定制服務(wù),望廣大科研工作者咨詢,。
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5分<IF≤8分 800元禮品,;
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