隨著生物醫(yī)藥的發(fā)展,，近年來各種大分子藥物不斷涌現(xiàn),，如蛋白三聚體、IgM分子,、病毒及病毒樣顆粒,、質(zhì)粒、外泌體等,，因此此類生物大分子的分離純化的需求也日益增加,。

傳統(tǒng)的層析填料如多糖基質(zhì)，雖具有生物相容性好,、比表面積高,、化學穩(wěn)定性好等特點,，但其質(zhì)地軟、孔徑?。ㄒ话阍?00 nm以下）的性質(zhì),，容易造成樣品傳質(zhì)速率慢、分離時間長,，樣品活性降低等問題,。因此，發(fā)展快速,、高效的分離技術(shù)至關(guān)重要,。大孔聚合物微球因其高比表面積、高機械強度和多樣表面特征,，常被用作層析分離純化的填料,。目前，已發(fā)展出多種表面基團及不同孔徑的聚合物層析填料,，成功應(yīng)用于疫苗,、病毒、抗體,、酶,、細胞因子等的分離純化，能有效的解決大分子蛋白純化中遇到的問題,。

01

大孔聚合物微球的優(yōu)勢

填料孔徑的大小會限制大分子物質(zhì)的吸附?：生物大分子如乙肝抗原,、類病毒在層析純化時，受孔徑限制,，大分子難以進入填料內(nèi)部,，影響吸附載量，而?增大孔徑則可以提高載量,。大孔聚合物填料孔徑（有100/500/1000 nm）,，允許大分子進入內(nèi)部孔道，從而顯著提高吸附載量,。例如,，定制化大孔DEAE填料對HBsAg（乙型肝炎病毒表面抗原）的吸附載量幾乎是瓊脂糖DEAE填料的20倍，有助于提高純化效率,。?傳統(tǒng)填料內(nèi)部孔道狹窄,，導(dǎo)致傳質(zhì)阻力大，層析柱壓力高,，這對于生物大分子的傳質(zhì)速率,、分離效率和結(jié)構(gòu)保持都產(chǎn)生了不利影響,。大孔填料中存在對流孔,，這有效克服了傳統(tǒng)填料的缺點,。對流孔的存在使得孔內(nèi)傳質(zhì)方式主要為對流，在提高流速和傳質(zhì)效率方面具有顯著優(yōu)勢,，有效解決了樣品因暴露在不穩(wěn)定環(huán)境中的時間過長而活性降低的問題,，從而提高樣品的活性回收率和產(chǎn)率。 大孔聚合物填料的優(yōu)點總結(jié)如下圖所示,。

02

大孔聚合物微球在生物大分子純化中的應(yīng)用

因其孔徑大,、有利于保持生物大分子的結(jié)構(gòu)、?機械強度高,、?處理量大等顯著的純化優(yōu)勢,，大孔聚合物微球在生物制藥領(lǐng)域中被廣泛應(yīng)用于各種生物大分子的純化和分離。例如Q 70M/L Phamc Beads超大孔陰離子交換層析介質(zhì),，粒徑70μm,，具有超大孔（500/1000nm）結(jié)構(gòu)，在質(zhì)粒三步法純化工藝中可有效去除痕量雜質(zhì)及內(nèi)毒素,，其工藝路線見下圖,。

質(zhì)粒三步層析法能夠?qū)崿F(xiàn)scDNA和ocDNA的全部分離，該方法穩(wěn)健高效,、高收率（樣品收率＞90%）,，高純度（純度＞95%），滿足了生物制藥和基因治療等領(lǐng)域?qū)Ω呒兌荣|(zhì)粒DNA的需求,。又如在AAV工藝開發(fā)中超大孔陰離子交換層析介質(zhì)能夠讓病毒進入微球內(nèi)部被吸附,，并且更大的保持病毒外殼的完整性，同時提高收率,，達到收獲高純度病毒的目的,。?AAV純化是基因治療中獲取高純度腺相關(guān)病毒（AAV）的關(guān)鍵步驟?。AAV純化策略的主線：澄清,、捕獲,、純化和精純。在收獲和細胞裂解后,，通過離心,、過濾等方法去除細胞碎片和雜質(zhì)。AAV的純化方案主要有以下三種（見下圖）,，可以獲得完整和更純凈的AAV,。

這三種方案中，方案一,、二是對AAV病毒更經(jīng)濟,、更便捷的純化方案，方案三為常用方法，AAV病毒親和純化填料,，效果很好但是價格高,。此外大孔聚合物微球還應(yīng)用在疫苗（滅活病毒、病毒樣顆粒）,、抗體,、血液制品（細胞因子、丙球蛋白）等,，應(yīng)用的程度也是越來越高,，其具體應(yīng)用如下圖所示。

03

應(yīng)用案例

① 大孔聚合物層析介質(zhì)用于人抗的分離純化

填料的孔徑越大,，蛋白分子能夠進入并接觸到的內(nèi)部表面積就越大,，從而提供了更多的吸附位點，增加了蛋白的載量,?？讖竭^小可能會限制蛋白分子的擴散，導(dǎo)致部分蛋白分子無法接觸到吸附位點,，還會增加傳質(zhì)阻力,，使得蛋白分子在填料中的傳遞變得困難，從而降低蛋白載量,。而孔徑適中或稍大則有利于蛋白分子的擴散,，提高吸附效率，從而增加蛋白載量,。蛋白分子的大小與填料孔徑的匹配性也是影響蛋白載量的重要因素,。如果蛋白分子過大而孔徑過小，那么蛋白分子可能無法進入孔徑內(nèi)部,，導(dǎo)致吸附效率降低,。因此，在選擇填料時,，需要考慮蛋白分子的大小與孔徑的匹配性,，以確保獲得較高的蛋白載量。

V1:SP 70S Phmac Beads人IgG樣品10%流穿時的體積;

V2: SP 70M Phmac Beads人IgG樣晶10%流穿時的體積;

V3: SP 70L Phmac Beads人IgG樣品10%流穿時的體積;

② 大孔聚合物層析介質(zhì)用于病毒的分離純化

大孔聚合物層析介質(zhì)孔徑通透性更好,，分子傳質(zhì)速度快,，可大幅度減少蛋白質(zhì)的失活，有效提高生物大分子的活性回收率和產(chǎn)率,。以下為大孔徑Q 70L Phmac Beads層析介質(zhì)在豬偽狂病毒純化中的數(shù)據(jù),，結(jié)果顯示大孔介質(zhì)對豬偽狂病毒的分離純化比傳統(tǒng)層析介質(zhì)具有明顯的優(yōu)勢。

超大孔 Q 70L Phmac Beads介質(zhì)對豬偽狂病毒純化色譜圖

Q 70L Phmac Beads和Smac Q 40對豬偽狂病毒純化回收率的比較
（Q 70L Phmac Beads超大孔徑（1000 nm）

層析介質(zhì),；Smac Q 40：瓊脂糖層析介質(zhì)）

04

其他應(yīng)用方向趨勢

1.該微球具有孔徑大,、比表面積高的特點,，適合生物大分子的傳質(zhì)和活性保持，基于本微球材料已經(jīng)開發(fā)了各種表面化學衍生及固定蛋白分子的技術(shù),，期望在固定化酶方面進一步推廣應(yīng)用,。2.基于該微球的優(yōu)良傳質(zhì)性能和高負載量的特點，可作為催化劑載體,，應(yīng)用于高通量水處理,。

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