BCA法是Lowry法的一種改進(jìn)方法,。與Lowery法相比，BCA法操作起來(lái)更加簡(jiǎn)單方便，其試劑及其形成的顏色絡(luò)合物穩(wěn)定性更好,，幾乎不受其他干擾物的影響，并且靈敏度高（微量檢測(cè)可達(dá)到0.5ug/ml）,，應(yīng)用起來(lái)更加靈活,。BCA法與Bradford法相比，BCA法的顯著優(yōu)點(diǎn)是不受去垢劑（SDS,，Triton X-100,，Tween-20等）的影響。

BCA法實(shí)驗(yàn)的原理

BCA是一種穩(wěn)定的堿性水溶性復(fù)合物,。在堿性條件下,，蛋白質(zhì)將Cu2+還原為Cu+，Cu+與BCA Reagent A（含有BCA）相互作用產(chǎn)生敏感的顏色反應(yīng),，形成紫色的絡(luò)合物,。該水溶性的復(fù)合物在A562 nm處顯示強(qiáng)烈的吸光性，吸光度和蛋白質(zhì)濃度在廣泛范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系,，根據(jù)吸光值可以推算出蛋白濃度,。

BCA實(shí)驗(yàn)物資與設(shè)備

? 物資清單

1. BCA試劑盒：通常包含BCA溶液A與B,，使用前需按比例混合均勻。

2. 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品：一般采用牛血清白蛋白（BSA）作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白,，用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,。

3. 比色皿：可選用96孔板或其他規(guī)格，用于盛放樣品并進(jìn)行光度測(cè)量,。

4. 離心管：用于樣品的制備與儲(chǔ)存,。

5. 移液器及配套吸頭：用于精確量取與添加不同體積的液體。

6. 去離子水：用于配制溶液與稀釋樣品

? 設(shè)備介紹

光譜光度計(jì)：在BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的過(guò)程中,，光譜光度計(jì)是需要的儀器，它用于測(cè)量樣品在特定波長(zhǎng)（562納米）下的吸光度,。在選擇光譜光度計(jì)時(shí)，應(yīng)關(guān)注以下幾點(diǎn)：

 • 精確度：儀器必須能夠精確讀取至0.001吸光單位的變化,。

 • 波長(zhǎng)范圍：確保設(shè)備能夠覆蓋所需的測(cè)試波長(zhǎng),，特別是BCA法所需的562納米。

 • 處理能力：根據(jù)實(shí)驗(yàn)規(guī)模,，選擇具有合適讀取速度與樣品處理能力的光度計(jì),，如單孔至多孔板光度計(jì)。

BCA實(shí)驗(yàn)操作步驟

一,、微孔板檢測(cè)

① BCA工作液配制,。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品數(shù)量，按50體積BCA 試劑A加1體積BCA 試劑 B（50:1）配制適量BCA工作液,，充分混勻,。

② 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。取一塊酶標(biāo)板（酶標(biāo)板的板底是不能用手去觸碰的,，一般拿的是側(cè)壁）,，按下表數(shù)據(jù)加入試劑：

③ 樣品準(zhǔn)備：將待測(cè)蛋白樣品用去離子水稀釋至適當(dāng)濃度，取20 ul樣品,，加入200 ul BCA工作液（蛋白液：工作液=1:20）,。加樣時(shí)槍要輕柔吹打，將其中液體混勻,。

④ 振蕩混勻后，37℃放置20 ~ 30 min,。冷卻至室溫,。顏色變化如下圖：

⑤ 用酶標(biāo)儀測(cè)定A562 nm處的吸光值，以不含BSA的吸光值為空白對(duì)照,。

⑥ 以蛋白含量(ug)為橫坐標(biāo),，吸光值為縱坐標(biāo),，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

⑦ 根據(jù)測(cè)得的吸光值,，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上即可計(jì)算出樣品的蛋白含量,。

⑧ 計(jì)算蛋白濃度：以查得的蛋白含量除以樣品體積20 ul，再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)即可得到待測(cè)樣品的實(shí)際濃度,。

二,、微孔板檢測(cè)

① BCA工作液配制。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品數(shù)量,，按 50 體積BCA Reagent A加1體積BCA Reagent B（50:1）配制適量BCA工作液,，充分混勻。

② 選取7支潔凈試管,，其中6支標(biāo)號(hào)1~6號(hào)管（包含第1支空白管），另外1支標(biāo)記待測(cè)管,。按照下表用移液器準(zhǔn)確移取相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液或待測(cè)樣品,、蒸餾水和BCA工作液于試管中。

③ 取適量體積的標(biāo)準(zhǔn)蛋白（根據(jù)情況用去離子水適度稀釋）,，以蛋白液：工作液=1:20 的比例混勻。37 ℃ 溫浴 30 min,。冷卻至室溫。

④ 然后吸取各試管中的溶液于比色皿中并用分光光度計(jì)的562nm波長(zhǎng)比色測(cè)定吸光度值,。

BCA實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

 • 為保證蛋白濃度測(cè)量的準(zhǔn)確性,，最好做3個(gè)復(fù)孔，必要時(shí)剔除離群值,。

 •  BCA法測(cè)蛋白濃度易受時(shí)間及溫度的影響,，所以最好每次測(cè)定都做標(biāo)準(zhǔn)曲線,。

 • 加樣時(shí)一定要準(zhǔn)確加樣且盡可能避免氣泡產(chǎn)生，以免影響測(cè)量（加樣結(jié)束可以用注射器戳破氣泡,，并將96孔板放在搖床上混勻片刻，以使樣品與工作液充分接觸）,。

 • 孵育結(jié)束應(yīng)盡快檢測(cè)吸光度,，并盡可能加快檢測(cè)速度,，以免帶來(lái)誤差,。