外泌體的分離多采用超速離心、磁珠免疫捕獲,、沉淀或過濾幾種方法，這些方法僅適用于前期研究,，對于后期工藝放大難以滿足,，限制了規(guī)模化生產(chǎn)藥品級外泌體治療產(chǎn)品供臨床使用,。致使有效的外泌體提取和外泌體純化工藝技術(shù)成為外泌體治療市場的一個(gè)關(guān)鍵技術(shù)阻礙,。

鑒于外泌體的多種功能和再生潛力，獲得高產(chǎn)量,、高純度和高質(zhì)量的外泌體至關(guān)重要,。目前，許多外泌體的分離技術(shù)都是基于它們的生物物理和/或生化特征,，如大小,、密度和特定表面標(biāo)記而開發(fā)的。但是,，由于要求的不同和生物流體的復(fù)雜性,，必須仔細(xì)考慮分離技術(shù)的選擇。

1,、 超離心（UC）使用100,000 g的離心力來有效地分離小顆粒,，如病毒、細(xì)菌和細(xì)胞器UC根據(jù)其主要作用機(jī)制大致可分為三類：差速離心(DC),、等密度梯度離心和速率帶離心(RZC),。UC一直被認(rèn)為是外泌體隔離的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”。然而,，每種生物流體的復(fù)雜性,、特定組成和物理性質(zhì)構(gòu)成了獲得可復(fù)制的純外泌體制劑的技術(shù)障礙。

a,、差速離心這項(xiàng)技術(shù)依賴于通過沉降沉淀法對顆粒進(jìn)行順序分離,，這取決于顆粒的大小和密度，通過使用一系列離心力和持續(xù)時(shí)間,。DC通過300至100,000 g的離心力進(jìn)行多次離心循環(huán),，通過控制不同的離心力和離心次數(shù)，依次去除細(xì)胞,、細(xì)胞碎片和凋亡小體,。最后一次離心(即100,000 g)后，通過去除上清來收集外泌體,。然而,，差速離心法有一些局限性,，例如耗時(shí)，需要昂貴的設(shè)備,，操作繁瑣,，并且在過高的轉(zhuǎn)速下破壞外泌體的完整性。此外,，一些脂蛋白可以與外泌體共沉淀因此,，我們提出了密度梯度離心法來提高外泌體的純度。

b,、使用兩種類型的密度梯度超離心：等重超離心和RZC,。DC經(jīng)常遭受污染和外泌體損失，因?yàn)橥饷隗w的不均勻性和細(xì)胞外囊泡大小有相當(dāng)大的重疊,。UC通常與等滲或RZC技術(shù)相結(jié)合,，以允許相對低密度的外泌體懸浮以進(jìn)一步凈化。該技術(shù)還可以提高外泌體的分離量,。典型的密度梯度UC包括以下步驟:首先,，將覆蓋樣品顆粒密度范圍的具有不同密度的生物相容性介質(zhì)層(例如，碘二醇或蔗糖)放入管中,，從底部到頂部密度逐漸降低,。然后將感興趣的樣品添加到密度梯度介質(zhì)的頂部，然后延長離心時(shí)間(例如,，100,000 g離心16小時(shí)),。與普通UC相比，密度梯度離心可有效提高外泌體的純度,，例如,，用密度梯度離心法從豬骨髓中分離骨髓細(xì)胞然而，蔗糖-密度梯度UC分離過程耗時(shí)長,，需要大量的生物樣品,，回收率較低。Kuipers等人發(fā)現(xiàn),，對于小密度梯度的離心過程,，碘沙醇比蔗糖更適合使用，因?yàn)樵诘馍炒继荻戎?，外泌體可以以相對更快的速度達(dá)到平衡,。因此，可以通過選擇合適的惰性介質(zhì)來優(yōu)化外泌體的分離,，從而提高分離效果,。

1. 超濾UF是一種基于物質(zhì)大小的分離方法，利用具有不同分子量截止點(diǎn)(MWCO)的膜分離外泌體，通常與其他方法聯(lián)合使用進(jìn)行進(jìn)一步純化,。與UC相比,，UF增加了囊泡隔離，顯著縮短了處理時(shí)間,，提高了吞吐量,，但不需要特殊設(shè)備。但由于剪切力的作用,，UF容易發(fā)生開裂和變形,，造成外泌體的損失。

基于超濾原理,，導(dǎo)出了切向流過濾和順序過濾方法。在TFF模式下,，樣品流體沿平行于膜的方向進(jìn)入,，調(diào)節(jié)了膜間壓力，減少了外泌體的損失和膜的堵塞,，延長了膜的使用壽命,。TFF在吞吐量、再現(xiàn)性,、時(shí)間,、成本和可擴(kuò)展性方面都超過了UC。

2.順序過濾是另一種常用的方法,，其中樣品首先通過1000 nm的過濾器去除細(xì)胞碎片和凋亡囊泡,，然后通過500-kD MWCO的第二個(gè)過濾器去除TFF中的游離蛋白。最后,，50 - 200nm直徑的材料可以通過200nm的過濾器進(jìn)行隔離,。該方法具有溫和、自動(dòng)化,、適合大顆粒的優(yōu)點(diǎn),，可用于生產(chǎn)尺寸均勻的外泌體，在很大程度上保證了外泌體的完整性和純度,。

為了克服傳統(tǒng)過濾的局限性,，Chernyshev等人開發(fā)了不對稱深度過濾(DF)，作為一種容易獲得的方法,，具有高收率和低外泌體污染,。常規(guī)過濾一般分為表面過濾和DF過濾。

在表面過濾過程中,，大顆粒由于其尺寸而被保留,，這些顆粒最終會(huì)在過濾介質(zhì)表面形成一個(gè)“餅”，而對于DF介質(zhì)，大空隙允許顆粒進(jìn)入介質(zhì)的孔隙,。因此,，不對稱DF方法的原理是，當(dāng)外泌體固定在多孔介質(zhì)表面和深度內(nèi)時(shí),，小顆?？梢员幌疵摗Ｔ摲椒ㄟm用于從用于培養(yǎng)ev分泌細(xì)胞的大量培養(yǎng)基中分離治療性外泌體,。

TunerSystems外泌體純化系統(tǒng) 是一款研發(fā)型自動(dòng)化過濾系統(tǒng),，理想的生物工藝開發(fā)研發(fā)階段自動(dòng)化切向流過濾系統(tǒng)，適合處理小體積的料液微濾和超濾,，最高可處理量15L,，循環(huán)體積可低至10mL。