Mechanical stress protects against chondrocyte pyroptosis through TGF-β1-mediated activation of Smad2/3 and inhibition of the NF-κB signaling pathway in an osteoarthritis model

Keywords: Chondrocyte; Exercise therapy; Mechanical stimulation; Osteoarthritis; Pyroptosis; TGF-β1.

骨關(guān)節(jié)炎（OA）是一種常見的慢性關(guān)節(jié)疾病,。研究學者推薦 OA 患者進行運動作為非藥物治療手段,。運動提供的機械力是軟骨穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵因素，包括軟骨細胞表型,、炎癥反應(yīng)和合成代謝-分解代謝平衡,。盡管運動療法得到了解剖學特征的支持,，但關(guān)于運動計劃的推薦持續(xù)時間和強度,，以及它們對 OA 提供保護的潛在機制一直存在爭議。

細胞焦亡是一種促炎性的程序性細胞死亡過程,，被認為與 OA 軟骨中存在空腔隙和細胞減少有關(guān),。一些研究已闡明了靶向焦亡以抑制或逆轉(zhuǎn) OA 的治療意義。因此,，有理由推測類似的細胞焦亡抑制可應(yīng)用于 OA 的運動療法,。

TGF-β1 是 TGF-β 超家族的一種亞型。低水平的 TGF-β1 可能導(dǎo)致軟骨退變,，TGF-β1 通路的激活對于在 OA 進展期間維持軟骨完整性至關(guān)重要,。相反，過度的 TGF-β1 信號會加劇軟骨和骨骼中的 OA 樣表型,。最近的一項研究證實,，血漿中的 TGF-β1 在運動后達到峰值,，并在 1 小時內(nèi)恢復(fù)到基線水平。這可能表明機械應(yīng)力促進了 TGF-β1 的內(nèi)源性產(chǎn)生,。因此,，調(diào)整運動強度，使軟骨細胞中的 TGF-β1處于適當濃度,，對于治療 OA 是值得的。

據(jù)此,，中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院超聲科,、急診科及骨外科的研究團隊推測 TGF-β1 在 OA 治療中充當運動和細胞焦亡之間的中繼站，并進行了深入研究,，旨在探討細胞焦亡在 OA 運動療法中的作用,，以及 TGF-β1 誘導(dǎo)的其調(diào)節(jié)機制。研究成果發(fā)表在 Biomedicine & Pharmacotherapy 期刊題為“Mechanical stress protects against chondrocyte pyroptosis through TGF-β1-mediated activation of Smad2/3 and inhibition of the NF-κB signaling pathway in an osteoarthritis model”,。該研究為 TGF-β1 在 OA 發(fā)病機制中的作用提供了見解,，并為 OA 患者提供了合適的運動計劃。

首先,，基于GEO公共數(shù)據(jù)庫對正常軟骨樣本和 OA 軟骨樣本GSE57218數(shù)據(jù)集進行分析,。與正常樣本相比，OA 軟骨中分別有大約 359 個和 357 個基因上調(diào)和下調(diào),。一些差異表達基因（DEGs）,，包括 TGF-β 家族成員，具有強烈的顯著差異,。與對照組相比,，OA 組的 TGF-β1 表達略有降低，這促使研究人員繼續(xù)探索機械應(yīng)力是否可以內(nèi)源性地恢復(fù) OA 軟骨中 TGF-β1 表達的降低,。

因此,，實驗繼續(xù)驗證 TGF-β1 與 OA 之間的關(guān)聯(lián)。通過 X 射線成像觀察到骨贅增生或關(guān)節(jié)間隙狹窄等 OA 特征（圖1 A）,。軟骨樣本分為未受損（U）和受損（D）區(qū)域,，H&E染色和甲苯胺藍染色顯示受損區(qū)域的 OARSI 評分顯著升高（圖1 B）。此外,，TGF-β1 表達的變化與膠原蛋白II 的變化一致,，在受損區(qū)域顯著低于未受損區(qū)域（圖1 C）。

圖1    與 OA 患者關(guān)節(jié)軟骨未受損區(qū)域的 TGF-β1 表達相比,，受損區(qū)域的表達下調(diào),。（A）OA 患者的 X 射線照片。（B）OARSI 評分的 OA 患者受損和未受損區(qū)域的 H&E 和甲苯胺藍染色,。（C）1-3 號患者軟骨中膠原蛋白II 和 TGF-β1 的蛋白質(zhì)印跡分析,。柱狀圖顯示了所有 8 名患者的統(tǒng)計數(shù)據(jù),。

接下來，對OA患者的軟骨細胞進行不同濃度 TGF-β1（0,、0.5,、1、2,、16 ng/mL）和不同強度循環(huán)拉伸應(yīng)力（CTS,，4%、6%,、8%,、10%，0.5 Hz,，12 h）干預(yù),。結(jié)果表明，TGF-β1 顯著增加細胞內(nèi)膠原蛋白II 的水平,，尤其是在 4 ng/mL 濃度時,。然而，與 4 ng/mL 相比,，高濃度的 TGF-β1 逆轉(zhuǎn)了這種作用,。此外，8% 強度的 CTS 會增加膠原蛋白II 的水平,，且TGF-β1 水平也隨著 CTS 強度的增加而升高,。值得注意的是，在 6%,、8% 和10% 強度下,，TGF-β1 水平與對照組有統(tǒng)計學差異。用 10 μM RepSox（TGFβ R-1抑制劑）抑制 TGF-β1 后,，無論是否進行 CTS 處理,，膠原蛋白II 的水平都會顯著降低。這表明,。CTS 通過增加 TGF-β1 來拯救OA 過程中的軟骨細胞,。

CTS 顯著降低細胞焦亡相關(guān)標志物 NLRP3、pro-caspase,、caspase 1,、IL-1β 和 GSDMD-N水平，而 TGF-RI,、Smad2,、Smad3 和 IκB 顯著升高（圖2 A）。這些趨勢在用 RepSox 處理后發(fā)生了逆轉(zhuǎn),，然而,，IκB 的結(jié)果卻相反,。

TGF-β1是NF-κB通路的上游調(diào)控因子，因此,，實驗探索了 NF-κB 通路（圖2 B）,。用 10 μM SIS3 阻斷 Smad 通路后，觀察到 TGF-β1 降低了細胞核中的 NF-κB p65,。免疫熒光染色描繪了 NF-κB 和 Smad 2 的亞細胞定位（圖2 C,、D）。在用 CTS 處理軟骨細胞期間觀察到 NF-κB 的核易位,，同時Smad2 的核易位被激活,。CTS 減弱了 ROS 在軟骨細胞中的積累以緩解氧化應(yīng)激，這可以通過 RepSox 阻斷 TGF-β1 來逆轉(zhuǎn)（圖2 E）,。TEM 圖像表明 CTS（8%，0.5 Hz,，12 h） 可以改善 OA 患者軟骨細胞的細胞形態(tài),，如細胞腫脹、細胞膜突出和細胞核皺縮（圖2 F）,。NLRP3 抑制劑 MCC950 和 CTS 在增加軟骨細胞膠原蛋白II 方面顯示出相似的作用,，這表明MCC950 可以減輕 OA。此外,，SYTOX 染色顯示 CTS 通過 TGF-β1 減少軟骨細胞死亡,，這可能暗示細胞焦亡受到抑制（圖2 G）?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明，CTS 通過 TGF-β1 協(xié)調(diào)激活 Smad2/3 并抑制 NF-κB 信號保護 OA 軟骨細胞免于焦亡,。

圖2     在 CTS 處理中,，升高的 TGF-β1 激活 Smad2/3 并抑制 NF-κB 核易位以抑制軟骨細胞焦亡。（A）CTS 和 10 μM RepSox 處理抑制 TGF-β1 下 NLRP3,、TGF-β R I,、Smad2、Smad3,、pro-caspase-1,、caspase-1、IκB-α,、IL-1β 和 GSDMD-N 的蛋白質(zhì)印跡分析,。（B）4 ng/mL TGF-β1 和 10 μM SIS3 處理以抑制 Smad 通路下細胞質(zhì)中 IκB-α、IL-1β 和 NLRP3 以及細胞核中 NF-κB p65 的蛋白質(zhì)印跡分析,。（C,、D）NF-κB p65 和 Smad 2 的核易位,。（E）軟骨細胞中的 ROS 熒光顯微鏡和流式細胞術(shù)。（F）軟骨細胞的TEM,。（G）軟骨細胞的 SYTOX 綠染色,。

最后，研究人員通過關(guān)節(jié)注射碘乙酸鈉（MIA）建立了大鼠膝關(guān)節(jié) OA 模型,，并進行了不同強度的跑步機鍛煉（圖3 A）,。OAG 大鼠的 Mankin 和 OARSI 評分顯著升高（圖3 B、C）,。跑步機運動在中等強度下達到最佳治療效果,，然而，根據(jù)改良的 Mankin 評分和 OARSI 評分,，高強度運動加劇了OA 進展（圖3 B,、C）。此外,，RepSox 對 TGF-β 1 的抑制逆轉(zhuǎn)了中等跑步機運動的治療效果（圖3 B,、C）。圖3 D的軟骨變化與圖3 F的H&E染色和甲苯胺藍染色一致,。OAM組比OAL和OAH組軟骨表面更光滑,，軟骨陷窩更豐富，療效最好,。X 射線成像和計算機斷層掃描也表明適度的跑步機運動緩解了關(guān)節(jié)間隙狹窄,、骨贅增生和軟骨下囊腫（圖3 E、G）,。

此外,，關(guān)節(jié)內(nèi)灌洗液（IALF）中 TNF-α 和 IL-1β 水平的變化與血清中相似，且在 OAM 大鼠中觀察到較低濃度,。OAM 大鼠中觀察到最佳治療效果,，膠原蛋白II 和 TGF-β 1 顯著增加，NLRP3,、caspase-1,、pro-caspase-1 和 IL-1β 顯著降低。這表明,，中等強度跑步機運動通過 TGF-β1 抑制細胞焦亡,，發(fā)揮軟骨保護作用。

圖3    中等強度跑步機運動在大鼠膝關(guān)節(jié) OA 模型中通過 TGF-β1 發(fā)揮最佳抗 OA 作用,。（A） 動物實驗設(shè)計（10 只大鼠/組）,。實驗組：CG = 對照組；OAG = 注射 MIA 的 OA 組,；OAL = OAG 進行低強度跑步機鍛煉（15.2 m/min with 0° of inclination,，60 min/day,，5 days/week for 4 weeks）；OAM = OAG 進行中等強度的跑步機鍛煉（19.3 m/min with 5° of inclination,，60 min/day,，5 days/week for 4 weeks）；OAH = OAG 進行高強度跑步機鍛煉（19.3 m/min with 5° of inclination,，60 min/day,，5 days/week for 4 weeks）；OAM + RepSox = OAM 與 RepSox 干預(yù),。（B）改良的 Mankin 分數(shù),，+aP = 0.024。（C）OARSI 分數(shù),。（D）大鼠膝關(guān)節(jié)的大體成像,。（E）大鼠膝關(guān)節(jié)的 X 射線成像。（F）大鼠膝關(guān)節(jié)的 H&E 和甲苯胺藍染色,。（G）大鼠膝關(guān)節(jié)的計算機斷層掃描成像,。

圖4     圖形概要

機械應(yīng)力通過增加 TGF-β 1 抑制軟骨細胞焦亡的相關(guān)分子機制。機械應(yīng)力通過 TGF-β1 對 Smad2/3 的協(xié)調(diào)激活和對 NF-κB 信號通路的抑制來防止焦亡,。運動誘導(dǎo)的 TGF-β1 升高與細胞膜上的 TGF-β1 I 型受體（TGF-β1 R1）結(jié)合。一方面,，這個過程促進了 Smad2/3 的募集,，導(dǎo)致 Smad2/3/4 復(fù)合物的形成。磷酸化的 Smad2/3/4 可以易位到細胞核,。然而,，TGF-β1 R1 的激活抑制了NF-κB-p65-IκBα 復(fù)合物中 NF-κB p65 的釋放，從而誘導(dǎo) NF-κB p65 的核易位,。在細胞核中,，Smad2/3/4 磷酸化的增加和 NF-κB p65 表達的降低通過調(diào)節(jié)下游基因的表達來抑制焦亡。

總之,，該研究表明,， OA 中中等強度的機械負荷保護軟骨細胞免受焦亡。機械刺激強度不當可能會加重體外和體內(nèi)的 OA,。此外,，TGF-β 1 的升高是機械刺激依賴性的，并對軟骨細胞焦亡產(chǎn)生抑制作用,。過量的內(nèi)源性 TGF-β1 可能是不適當?shù)倪\動誘導(dǎo)的 OA 進展的潛在原因,。運動誘導(dǎo)的 TGF-β1 協(xié)調(diào)激活 Smad2/3 并抑制 NF-κB 信號通路以抑制 OA 中的焦亡。因此,，這項研究為開發(fā)安全有效的 OA 運動療法提供了理論框架,。

參考文獻：Wang Y, Jin Z, Jia S, Shen P, Yang Y, Huang Y. Mechanical stress protects against chondrocyte pyroptosis through TGF-β1-mediated activation of Smad2/3 and inhibition of the NF-κB signaling pathway in an osteoarthritis model. Biomed Pharmacother. 2023 Mar;159:114216. doi: 10.1016/j.biopha.2023.114216. Epub 2023 Jan 11. PMID: 36634591.

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