在生物制藥領(lǐng)域,，對(duì)宿主細(xì)胞蛋白(HCPs)的精準(zhǔn)分析與控制是確保藥物安全與有效性的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。各國法規(guī)都有關(guān)于HCPs的論述，要求必須對(duì)生物藥品進(jìn)行分析和純化,，以將宿主細(xì)胞蛋白HCPs降低到可接受的水平,。

不同監(jiān)管機(jī)構(gòu)宿主細(xì)胞蛋白(HCPs)法規(guī)要求:

• 《中國藥典》(2020版)三部規(guī)定：針對(duì)CHO細(xì)胞，HCPs殘留需要<0.05%(相當(dāng)于小于500ppm),；針對(duì)E.coli,，HCP殘留需要<0.01%。

• 美國藥典USP<1132>章節(jié)規(guī)定：用一種靈敏度較高的方法檢測(cè)藥品中的HCPs,，其含量應(yīng)該低于檢測(cè)限(通常小于100ppm,，即1mg總蛋白中HCPs含量應(yīng)小于100ng，也即<0.01%),。

• 歐洲藥典EP 2.6.34中規(guī)定：在生物制品中,，HCP的含量應(yīng)當(dāng)小于0.1%。

• 國際人用藥品注冊(cè)技術(shù)協(xié)調(diào)會(huì)(ICH)指南：ICH Q6B指出,，需要根據(jù)ICH準(zhǔn)則采用敏感且經(jīng)過驗(yàn)證的有效方法來監(jiān)控殘留的HCPs,，其殘留量通常要求小于100ppm。

• ELISA是各國藥典推薦的在生物制品中檢測(cè)殘留HCPs的方法,，可以測(cè)定HCPs的總量,。并且ELISA的操作簡(jiǎn)便，是經(jīng)典的免疫學(xué)檢測(cè)方法,。但ELISA檢測(cè)HCPs也有方法的局限性,，比如不能從ELISA的結(jié)果中知道樣品中有哪些HCPs，或者用于檢測(cè)的抗體與哪些HCPs發(fā)生了免疫反應(yīng),。因此,，監(jiān)管部門要求在使用ELISA檢測(cè)過程中HCPs殘留含量時(shí)，不僅要通過方法學(xué)驗(yàn)證證明試劑盒的準(zhǔn)確度,，精密度,，靈敏度等，而且還需要證明使用的HCPs抗體有廣泛的反應(yīng)性,，即HCPs抗體覆蓋率,。
  

圖 1 HCP ELISA試劑盒檢測(cè)流程

什么時(shí)候做HCPs抗體覆蓋率驗(yàn)證？

美國藥典USP<1132>和歐洲藥典EP2.6.34. HOST-CELL PROTEIN ASSAYS將HCPs檢測(cè)方法分為：商業(yè)化試劑盒,、產(chǎn)品/工藝專屬性方法和平臺(tái)化方法,。并指出在產(chǎn)品開發(fā)的不同階段，推薦采用不同的ELISA試劑盒用于HCPs的檢測(cè),。

USP<1132>提到在沒有平臺(tái)化方法的情況下可以在臨床前,、臨床I期、II期使用商品化試劑盒,；在臨床III期/工藝驗(yàn)證及產(chǎn)品上市后,，由于商業(yè)化的通用HCP檢測(cè)試劑盒抗體的覆蓋率往往不足等局限性,，需要考慮結(jié)合細(xì)胞類型及工藝特異性等因素，使用平臺(tái)化方法或針對(duì)上游工藝開發(fā)的產(chǎn)品/工藝專屬性方法,。

而在臨床II期后若是需要繼續(xù)使用商品化試劑盒,，就需進(jìn)行HCPs抗體覆蓋率驗(yàn)證來評(píng)估試劑盒是否可以繼續(xù)用于質(zhì)量監(jiān)控。通常推薦在臨床II期末或者臨床三期前的這個(gè)階段去做覆蓋率驗(yàn)證,，此時(shí)生產(chǎn)工藝已經(jīng)固定并且有相對(duì)充足的時(shí)間,。

圖2 USP<1132>產(chǎn)品開發(fā)的不同階段HCP檢測(cè)方法的建議

HCP覆蓋率驗(yàn)證的不同技術(shù)路線

傳統(tǒng)的分析方法采用2D Western blot進(jìn)行覆蓋率驗(yàn)證，是基于等電點(diǎn)和分子量不同的原理,，蛋白在凝膠上通過SDS-PAGE方法被分離,。其中一張膠被銀染，另一張被轉(zhuǎn)到PVDF膜上,，并結(jié)合ELISA試劑盒中的抗體進(jìn)行Western Blotting檢測(cè),。但因其固有的方法學(xué)限制和技術(shù)挑戰(zhàn)，往往難以全面,、準(zhǔn)確地評(píng)估多克隆抗體對(duì)HCPs的覆蓋范圍,。

2D WB方法限制因素：

• 負(fù)載能力低

• 樣品經(jīng)過前處理會(huì)破壞蛋白天然表位

• HCPs結(jié)合到PVDF膜上導(dǎo)致損失部分檢測(cè)到的抗體信息

• 難以將PAGE凝膠與WB圖片對(duì)齊

• 特異性差，顯著低估真實(shí)抗體覆蓋率

為了克服這一難題,，Cygnus Technologies于2014年創(chuàng)新性地推出了抗體親和提取(Antibody Affinity Extraction,，AAE™)技術(shù)，目的是提高細(xì)胞培養(yǎng)收獲液中總HCPs混合物的靈敏度和覆蓋率評(píng)估,，并可以檢測(cè)對(duì)下游工藝特異性HCPs的反應(yīng)性,，這些通常也是最為關(guān)注的HCPs。與2D-PAGE和2D-WB的靈敏度受負(fù)載能力等限制不同,，AAE™的靈敏度可高出100倍以上,，因?yàn)樗軌蛱崛『蜐饪s大量樣品。

表1 AAE與2D-WB覆蓋率技術(shù)路線對(duì)比

AAE分析流程首先將多克隆抗體共價(jià)固定在色譜柱上,。然后對(duì)色譜柱進(jìn)行條件調(diào)節(jié),，以防止抗體的顯著浸出并極大地減少任何非特異性結(jié)合,。原始未變性的HCPs樣品通過色譜柱與抗體進(jìn)行結(jié)合，隨后用酸洗脫,。通過結(jié)合和洗脫,，HCPs樣品再次在柱上循環(huán)，直到?jīng)]有其他HCPs被結(jié)合,。所有收集的HCPs洗脫液再匯集,、交換緩沖液并濃縮回原始樣品體積，為后續(xù)的分析提供高質(zhì)量的樣本,。在收集到HCPs樣本后,，可以選擇通過2D-PAGE+銀染或MS質(zhì)譜進(jìn)行后續(xù)分析,。

圖3 USP<1132>產(chǎn)品開發(fā)的不同階段HCP檢測(cè)方法的建議

抗體對(duì)下游HCPs的反應(yīng)性和AAE-MS™的HCPs鑒定

  AAE™技術(shù)的優(yōu)勢(shì)不僅在于其高靈敏度，更在于其強(qiáng)大的預(yù)測(cè)能力和廣泛的應(yīng)用前景,。通過AAE-MS™獲得的覆蓋率的結(jié)果更高,、更真實(shí)，可以更準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)抗HCPs抗體在ELISA中的表現(xiàn),。并且,，AAE™與質(zhì)譜聯(lián)用(AAE-MS™)能夠識(shí)別收獲材料中與抗體反應(yīng)的HCPs，并獲得蛋白質(zhì)的分子量和等電點(diǎn)(pI)信息,，可以評(píng)估純化過程中持續(xù)存在的單個(gè)HCPs,，并優(yōu)化下游純化工藝。

圖4 F650S HEK2 93抗體覆蓋率驗(yàn)證

值得一提的是,，AAE™技術(shù)在檢測(cè)并證明對(duì)單個(gè)下游HCP的反應(yīng)性方面表現(xiàn)出色,。更主要的是質(zhì)譜可以對(duì)樣品中是否存在潛在高風(fēng)險(xiǎn)的HCPs做出鑒定并提供這些蛋白的注釋信息。通過AAE™技術(shù),，能夠更準(zhǔn)確地識(shí)別和量化這些高風(fēng)險(xiǎn)HCPs,。這些通過特定純化過程持續(xù)存在的高風(fēng)險(xiǎn)HCPs對(duì)于患者安全、藥物功效和穩(wěn)定性至關(guān)重要,，無論是藥物研發(fā)人員還是監(jiān)管人員都能通過這一技術(shù)清楚地了解工藝中某個(gè)HCP的殘留情況,，從而為藥物的研發(fā)和生產(chǎn)提供強(qiáng)有力的支持。

表2 CHO細(xì)胞高風(fēng)險(xiǎn)HCPs

A

AAE-MS™在藥物原液和過程樣品監(jiān)控中的應(yīng)用

AAE-MS™也可以對(duì)藥物原液中HCPs富集的同時(shí)去除了大部分原料藥,。去除原料藥極大地提高了通過2D-PAGE和質(zhì)譜分析識(shí)別單個(gè)HCPs的能力,，因?yàn)樗幤吠ǔＲ?/span>104-106的倍數(shù)掩蓋HCPs。AAE-MS™是一種更客觀和直接的方法檢測(cè)和鑒定原料藥中任何潛在的HCPs雜質(zhì)以幫助優(yōu)化下游純化工藝,。

圖5 AAE對(duì)藥物原液中HCPs的富集

圖6  AAE-MS™對(duì)藥物原液中高風(fēng)險(xiǎn)HCPs的富集和鑒定

總之,，抗體親和提取(AAE™)技術(shù)以其優(yōu)良性能和廣泛的應(yīng)用前景，正在逐步成為生物制藥領(lǐng)域HCPs分析的新標(biāo)準(zhǔn),。它不僅能夠克服傳統(tǒng)方法的局限性,，更在靈敏度、預(yù)測(cè)能力和應(yīng)用深度上實(shí)現(xiàn)了顯著提升,。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展和完善,，相信AAE™將在未來為更多藥物的研發(fā)和生產(chǎn)貢獻(xiàn)力量，為患者帶來更加安全,、有效的治療方案助力,。

支持文獻(xiàn)

[1] USP<1132>Residual Host Cell Protein Measurement in Biopharmaceuticals.

[2] USP<1132.1>Residual Host Cell Protein Measurement in Biopharmaceuticals by Mass Spectrometry.

[3] EP-2.6.34. Host-Cell Protein Assays.

[4] Host Cell Protein Analysis: Immunoassays and Orthogonal Characterization By Antibody Affinity Extraction and Mass Spectrometry Methods

[5] Antibody Affinity Extraction (AAE™) - A superior alternative to 2D Western blot for determination of polyclonal anti-HCP reactivity.

[6] Antibody Affinity Extraction (AAE™) Empowers HCP Identification by Mass Spectrometry.

Cygnus Technologies專注為生物技術(shù)和生物制藥行業(yè)提供產(chǎn)品和分析方法超過25年，旨在加速研發(fā)階段和提高產(chǎn)品質(zhì)量,。Cygnus開發(fā)和生產(chǎn)的生物工藝殘留試劑盒,，用于檢測(cè)超過50種不同表達(dá)系統(tǒng)的特異性雜質(zhì)。Cygnus作為專注于生物技術(shù)應(yīng)用免疫檢測(cè)的高靈敏度分析技術(shù)的專家,，其產(chǎn)品和服務(wù)已經(jīng)被全球超過95%以上生物制藥公司使用,，并獲得FDA,、NMPA、EMA等監(jiān)管機(jī)構(gòu)的廣泛認(rèn)可,。

北京西美杰科技有限公司作為Cygnus在中國總代理,，與國內(nèi)眾多藥企，CRO/CMO企業(yè)建立了長久穩(wěn)定的合作關(guān)系,。多年來西美杰的產(chǎn)品及服務(wù)幫助許多企業(yè)加速R&D階段,，提高藥物質(zhì)量、純度和安全,，加速優(yōu)化研發(fā)工藝,，減少產(chǎn)品上市時(shí)間，降低QC成本,。