高效液相色譜及高效液相的分離原理是什么呢,？

  高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatography，HPLC,，又稱為“高壓液相色譜和高分離度液相色譜等”）是一項重要的分析分離技術(shù),，用于分離和鑒定混合物中的多種組分，并對各種組分進(jìn)行定量分析,。 HPLC采用高壓輸送系統(tǒng),，將含有樣品溶液的不同極性的（單一或不同比例混合）溶劑和流動相泵入填充有固定吸附材料的色譜柱中。樣品中不同組分在兩相中具有不同的分配系數(shù),，在色譜柱中做相對運動時,，經(jīng)過反復(fù)多次的吸附-解吸的分配過程，使不同組分在移動速度上產(chǎn)生較大差別,，從而實現(xiàn)分離,。

為什么色譜峰會出現(xiàn)拖尾？

1. 樣品溶劑極性過強——解決辦法：確保樣品溶劑極性低于或者等同于流動相極性,；

2. 色譜柱超載——解決辦法：減少進(jìn)樣體積或減小進(jìn)樣濃度,；

3. 篩板堵塞或柱失效——解決辦法：反向沖洗色譜柱，替換篩板或更換色譜柱,；

4. 存在干擾峰——解決辦法：使用更長的色譜柱,，或更換流動相,，或更換選擇性更好的色譜柱；

5. 色譜柱塌陷,、污染等色譜柱本身的問題——解決辦法：更換色譜柱,。

為什么色譜峰出現(xiàn)雙峰或分叉？

色譜雙峰指的是一種物質(zhì)在一張色譜圖中出現(xiàn)兩個峰,。這種情況可能由于：

1. 溶劑極性及進(jìn)樣量——解決辦法：當(dāng)溶劑的極性與流動相的極性相差非常大也可能出現(xiàn)雙峰,，將進(jìn)樣量減少一半以上；當(dāng)進(jìn)樣量不大,，但是濃度很大時,，則考慮是色譜柱過載，將樣品稀釋后再進(jìn)樣,；

2. 樣品體積過大——解決辦法：用流動相配樣,，總的樣品體積小于第一峰的15%；

3. 流動相比例不合適——解決辦法：調(diào)節(jié)有機相比例,；

4. 樣品溶劑極性過強——解決辦法：采用較弱的樣品溶劑,；

5. 樣品的特性——解決辦法：動態(tài)平衡的互變異構(gòu)現(xiàn)象，如紅霉素,；

6. 色譜柱——解決辦法：原色譜峰出現(xiàn)雙峰且一大一小,，可以判斷色譜柱柱頭受堵，將色譜柱反過來接,，用流動相沖洗或用酸洗或其他試劑,；

7. 柱塌陷或形成短路通道——解決辦法：更換色譜柱,，采用較弱腐蝕性條件,；

8. 柱內(nèi)燒結(jié)不銹鋼失效——解決辦法：更換燒結(jié)不銹鋼，加在線過濾器,，過濾樣品,。

為什么色譜圖中出現(xiàn)“鬼峰”,？

當(dāng)色譜圖上出現(xiàn)比較雜亂且詭異的峰時我們稱它為“鬼峰”,。這種情況可能由于：

1. 上次進(jìn)樣的殘留——解決辦法：用強溶劑沖洗色譜柱，并用初始流動相平衡色譜柱30 min及以上,；

2. 溶劑中有氣泡——解決辦法：溶劑脫氣,；

3. 樣本中存在不明干擾物——解決辦法：樣本凈化或預(yù)分離；

4. 色譜柱未平衡——解決辦法：重新平衡色譜柱,，用流動相作樣品溶劑（尤其是離子對色譜）,；

5. （TFA）氧化——解決辦法：每天新配，用抗氧化劑,；

6. 溶劑污染——解決辦法：使用新配制的HPLC級溶劑,，梯度方法常表現(xiàn)為“鬼峰”,。

為什么色譜峰峰型展寬，變成“矮胖型”,？

色譜圖在正常的情況下是“瘦高型”的,，變成“矮胖型”是色譜峰峰型展寬導(dǎo)致。這種情況可能由于：

1. 柱子沒有平衡好——解決辦法：用流動相重新平衡色譜柱,；

2. 樣本溶劑極性過強——解決辦法：確保樣品溶劑低于或者等同于流動相的強度,；

3. 進(jìn)樣量過大——解決辦法：減少進(jìn)樣體積，避免樣品過載,；

4. 進(jìn)樣濃度過大——解決辦法：減少進(jìn)樣濃度,，避免樣品過載；

5. 流動相比例不合適——解決辦法：調(diào)節(jié)有機相比例,；

6. 溫度波動——解決辦法：使用恒溫控制的柱溫箱,，溫度越高峰形越尖銳；

7. 流動相粘度太高——解決辦法：增加柱溫,；

8. 保留時間長——解決辦法：用梯度洗脫或更強的流動相,；更換短的色譜柱；

9. 色譜柱塌陷——解決辦法：更換新的色譜柱,；

10. 檢測器時間常數(shù)慢——解決辦法：調(diào)節(jié)時間常數(shù)使之與峰寬匹配,。

為什么色譜圖中出現(xiàn)倒峰？

1. 常為溶劑峰,，樣本的溶劑的極性和光吸收度與流動相相差很大,，而進(jìn)樣量又較大的話，樣本的溶劑不能和流動相充分混合均勻,，溶劑被洗脫形成一個峰,，如果溶劑的紫外吸收比流動相小，就會出現(xiàn)負(fù)峰,；或流動相加了有一定紫外吸收的添加劑,，而樣品中含有無紫外吸收的無機鹽或其它物質(zhì)時,，也會出現(xiàn)負(fù)峰——解決辦法：用流動相作為樣本溶劑,，使用高純度的溶劑作為流動相；

2. 折光檢測器：溶質(zhì)折射率小于溶劑折射率——解決辦法：無誤,；將極性調(diào)反使之為正,；

3. 樣品中的雜質(zhì)沒有紫外處吸收或吸收很小，而流動相紫外吸收大時,，如用甲醇時波長設(shè)定在220nm以下時,，常出現(xiàn)這種現(xiàn)象；

4. 進(jìn)樣過程中進(jìn)入了空氣也會導(dǎo)致的,。

用液相測定多種物質(zhì)時,，怎樣可以使色譜圖中的色譜峰位發(fā)生重排呢,？

在分析多組分樣品時,，僅改變流動相的強度（組成百分比）而不改變其組成,，一般僅僅改變所有組分的保留時間，不會發(fā)生峰位的重排,。以下條件的改變可能發(fā)生峰位重排：

1. 流動相中換了強溶劑,；

2. PH值的改變；

3. 色譜柱填料的改變,；

4. 柱溫的改變,；

5. 流動相的組成改變（如加入離子對試劑三乙基胺等）。