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【飛諾美色譜】臨床樣本中類固醇激素前處理解決方案-SPE

來源:艾杰爾飛諾美   2024年12月11日 16:46  

類固醇激素,,又稱甾體激素,是一類四環(huán)脂肪烴化合物,具有環(huán)戊烷多氫菲母核,,因其在維持生命,、調(diào)節(jié)性功能,、對機(jī)體發(fā)展,、免疫調(diào)節(jié)、皮膚疾病治療及生育控制方面的作用,,臨床表征中經(jīng)常會作為疾病診斷的參考,,因此,相關(guān)激素在臨床樣本中準(zhǔn)確的定性和定量分析就變得尤為重要,。在上周的推文中,,我們分享了用LC-MS/MS方法檢測臨床19種類固醇激素的解決方案,該方案的完整執(zhí)行,,離不開合適的前處理基礎(chǔ),,這周我們就為大家分享其中一種基于SPE的前處理方法。


整個SPE方案的考察過程中,,我們對淋洗和洗脫方案進(jìn)行了相應(yīng)優(yōu)化,。對于淋洗方案,首先嘗試了甲醇與水的不同比例,,從10%的甲醇/水增加到90%的甲醇/水,,其中好的結(jié)果為30%甲醇/水的比例。而后接著嘗試了兩種洗脫方案,,第一種為1%甲酸水淋洗后采用30%甲醇/水淋洗,,第二種為30%甲醇/水淋洗后采用正己烷淋洗。對于所有淋洗方案來說,,1%甲酸水淋洗后采用30%甲醇/水淋洗的方式回收率最佳,。在洗脫方案中,同樣進(jìn)行了一些嘗試,,最終決定采用甲醇:乙腈(1/4)進(jìn)行洗脫,。以下為優(yōu)化后的SPE方案:


步驟操作
樣品預(yù)處理500µL血清樣本與500µL 1%甲酸水混合
活化1mL甲醇活化Strata-X, 33µm聚合物反相,30mg 96孔板(貨號: 8E-S100-TGB)
平衡1mL水
上樣1mL預(yù)處理后的樣品(10µL內(nèi)標(biāo))
淋洗11mL 1%的甲酸水溶液
淋洗21mL 30%的甲醇/水溶液,,真空抽干
洗脫2X500µL甲醇:乙腈(1:4, V:V)
氮吹濃縮45℃
復(fù)溶100µL 0.5mM的氟化銨水溶液/甲醇(60:40, V:V)溶液




圖3 Kinetex C18分離類固醇相關(guān)異構(gòu)體總離子流圖




圖4 部分化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線


表3 標(biāo)準(zhǔn)曲線,,LLOQ和S/N結(jié)果匯總




Kinetex 2.6µm C18色譜柱在正離子和負(fù)離子模式下能對分析物提供8分鐘之內(nèi)的高選擇性分析結(jié)果(見圖3),。具有相同質(zhì)荷比的異構(gòu)體也完成了分離。標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好,,分析物R2均大于0.99(見表3),。三種濃度下的三份加標(biāo)樣品的準(zhǔn)確度為80%~120%。除DHEAS回收率為54%之外,,其他所有分析物的低濃度加標(biāo)樣品的回收率為81%~116%,;除DHEAS回收率為61%之外,,所有其他分析物中濃度加標(biāo)樣品的回收率為80%~96%,;除DHEAS回收率為59%之外,所有其他分析物高濃度加標(biāo)樣品的回收率為82%~102%(見表4),。要提高DHEAS的回收率,,就要采用不同的洗脫方案。分析物的加標(biāo)樣品精密度(%RSD)均小于15%(見表5),。




PS: pre-spiked samples

PoS: post-spiked samples


表4 回收率及準(zhǔn)確度結(jié)果




表5 精密度,,基質(zhì)效應(yīng)和方法回收率結(jié)果




根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,上述方法可作為血清中類固醇激素分析的一種高效,、重現(xiàn)性良好的前處理方法,。使用Strata-X 96孔板可以作為有效凈化手段,同時采用Kinetex 2.6µm C18, 50x3.0mm色譜柱可在8分鐘內(nèi)對相關(guān)類固醇分析物進(jìn)行有效分離,,同時對異構(gòu)體進(jìn)行分離從而實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確定量,。

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