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熒光定量PCR儀的核心在于利用熒光信號來實時監(jiān)測PCR過程中DNA或RNA樣本的擴(kuò)增情況,，從而實現(xiàn)對目標(biāo)基因的精確定量分析,。在熒光定量PCR中,，首先需要將待測樣本與特異性引物,、DNA聚合酶以及熒光基團(tuán)或熒光標(biāo)記的探針混合，形成一個反應(yīng)體系,。然后,，通過設(shè)定特定的PCR程序，如退火溫度,、延伸時間等,，使得DNA在PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。在PCR反應(yīng)過程中,，每當(dāng)一個DNA被擴(kuò)增時,，與之結(jié)合的熒光基團(tuán)或探針就會發(fā)出熒光信號。熒光定量PCR儀通過高靈敏度的熒光檢測系統(tǒng),，實時收集并分析這些熒光信號,，將其轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號，從而精確地反映出PCR產(chǎn)物的生成量,。
一,、操作步驟
打開電腦和熒光定量PCR儀的軟件，設(shè)置PCR儀各通道的光電倍增器(PMT)電壓,。
將需要擴(kuò)增的樣品模板,、引物、探針和內(nèi)參照熒光探針分別加入到樣品孔和試劑孔中,。
加入PCR擴(kuò)增試劑,，包括緩沖液、引物、探針和內(nèi)參照熒光探針,。
啟動PCR擴(kuò)增儀,，設(shè)定循環(huán)參數(shù)，包括預(yù)變性,、變性,、復(fù)性、延伸和熒光檢測條件,。
在每個循環(huán)中,，加入相應(yīng)的預(yù)變性液、復(fù)性液,、延伸液和檢測液,，并維持一定的時間。
每次循環(huán)結(jié)束后,，PCR儀自動收集信號并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,。
經(jīng)過多次循環(huán)后，PCR儀將自動停止運行并輸出結(jié)果,。
二,、維護(hù)保養(yǎng)
儀器外表應(yīng)定期用軟布加少數(shù)清水擦洗，清洗后將儀器擦干,。若有試劑泄漏在儀器外表,，應(yīng)使用軟布加70%酒精擦洗潔凈。
反應(yīng)孔應(yīng)定期清潔,，一般3個月一次,，可用吹氣球輕輕吹拭。為了防止塵土進(jìn)入反應(yīng)孔,，儀器不使用時,，應(yīng)關(guān)閉滑蓋。若有試劑進(jìn)入樣本孔內(nèi),，應(yīng)使用無塵軟布加70%酒精擦洗潔凈,。
不要頻頻開關(guān)儀器，兩次開關(guān)間隔時間不得低于30秒,。試驗結(jié)束后不要當(dāng)即關(guān)閉電源,，應(yīng)待機(jī)10分鐘后再關(guān)閉電源。
應(yīng)使用原廠商供應(yīng)的電源線和通訊線,，禁止在儀器上進(jìn)行沸水浴或低溫保溫(如4℃),。
儀器裝有兩個10A保險絲，用以保護(hù)儀器,。當(dāng)保險絲發(fā)生損壞后,，用戶應(yīng)按說明書中的方法替換保險絲。
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