不同大小的蛋白質(zhì)分子進(jìn)入膠體過濾管柱,，可依其分子量差異分離,；是一種廣泛應(yīng)用的partition色析法 （Pharmacia操作手冊, Gel Filtration）,。

儀器設(shè)備：色析管柱 （Pharmacia C column, 1.6×100 cm）,、鐵架、鐵夾及水平儀,；分劃收集器 （fraction collector, 需準(zhǔn)備干凈試管約100 支）,；濃縮用離心機(jī) （低速5,000 rpm）,；濃縮用離心管Centriprep-30 （Amicon 4322） 請注意其使用方法

藥品試劑：膠體Sephacryl S-300 （Pharmacia）：a. 預(yù)先以緩沖液buffer A-150 平衡好，并且使*沈降后的膠體體積,，占全部體積的七至八成,；要先預(yù)估好膠體的使用量。b. 膠體溫度要與操作場所的溫度一致,，否則溫度變化會產(chǎn)生氣泡,。c. Sephacryl 系列膠體有相當(dāng)大的吸附力，因此要在緩沖液加入0.15 M 以上的NaCl 以除去非專一性吸附,。Buffer A-150：注意使用時(shí)的溫度要與管柱膠體的溫度一致標(biāo)準(zhǔn)分子量組合 （Bio-Rad 151-1901）：溶于1 mL 后每組取0.4 mL,。含有thyroglobulin （670 kD）, bovine gamma globulin （158 kD）, chicken ovalbumin （44 kD）, equine myoglobin （17 kD）, vitamin B12 （1,350）

方法步驟：

管柱裝填：1） 以純水沖洗玻璃管柱 （以純水上下沖洗即可，嚴(yán)禁使用試管刷）；并請了解管柱的構(gòu)造與拆裝方法,，垂直架好管柱,，以軟管連接分劃收集器，并以bufferA-150 試看管路是否通暢,；可以用止血鉗或長尾文書夾夾住出口軟管,，則可控制溶離的進(jìn)行,。 注意系統(tǒng)的擺設(shè)要適當(dāng),，不要裝置于交通要沖。2） 依預(yù)估量取出Sephacryl 膠體,，注意膠體的溫度與緩沖液是否已平衡,；將瓶中的膠體上下震蕩,，使的*懸浮,，但勿產(chǎn)生太多氣泡,。3） 在管柱內(nèi)加入約10 cm 高緩沖液，然后將膠體慢慢沿著管壁倒入管柱,，一直加到管柱頂端,，開始流洗后膠體沈降很快,。當(dāng)膠體上方的液面逐漸降低時(shí)，可于頂端添加膠體,，以達(dá)所要高度,；膠體高度約90 cm。4） 膠體*沈降后,，小心以buffer A-150 加滿管柱,，關(guān)閉出口，裝上頂端端蓋并連通緩沖液瓶,，打開出口以重力流洗,。 調(diào)整緩沖液瓶高度，使流速約每五~六秒一滴,，并設(shè)定收集體積為2.5 mL/tube,。5） 膠柱流洗約100 mL 后，關(guān)閉出口,，拆開頂端端蓋,，先以滴管吸出膠體上方的溶液到剩約1 cm 高，注意勿破壞膠體表面平整,； 然后打開出口,，使液面下降至膠體面，再關(guān)閉出口,，準(zhǔn)備注入樣本,。

樣本色析進(jìn)行：6） 以微量移液器或滴管吸取樣本 （樣本體積不得超過膠體總體積的3%），沿著膠體上方管壁緩慢加入,，注意切勿破壞膠體的平整表面?。颖敬_實(shí)體積 _______ mL）7） 打開出口，同時(shí)開啟分劃收集器,；當(dāng)樣本*沒入膠體時(shí),，關(guān)閉出口，緩緩加入與樣本相等體積的buffer A-150,，打開出口待其慢慢進(jìn)入膠體中,，如此重復(fù)二次。不得擾動膠體表面,，造成凹陷,。8） 暫時(shí)關(guān)閉出口，將液面高度加滿至管柱頂端,，并把頂端端蓋鎖上,；然后打開出口開始溶離，調(diào)整緩沖液瓶的高度,，使流速為6 s 一滴,。9） 要留心觀察前面幾個(gè)分劃，確定整個(gè)系統(tǒng)運(yùn)轉(zhuǎn)無礙,，小心分劃收集器zui容易出問題,。管柱預(yù)計(jì)將流洗過夜，收集約80 管,。10） 收集分劃試管,，進(jìn)行蛋白質(zhì)定量分析以及GUS 活性測定，并請作圖,。11） 收集GUS 活性區(qū),，以Centriprep-30 濃縮至10 mL 后,，加buffer A-0 稀釋至20 mL,，再次濃縮至 _______ mL （GF），保留100 μL,。12） 管柱請?jiān)僖詁uffer A-150 流洗100 mL 后,，小心放置一旁,，準(zhǔn)備以后進(jìn)行分子量測定。

分子量測定：13） 進(jìn)行分子量測定前一天,，請先以buffer A-150 流洗100 mL,，并檢查膠柱內(nèi)有無氣泡產(chǎn)生，若有嚴(yán)重的氣泡或干裂,，必須重新裝填管柱,。14） 取標(biāo)準(zhǔn)分子量溶液0.4 mL，加上純質(zhì)目標(biāo)酶0.5 mL （以親和層析法所得的AF 部份）,，如上法注入管柱中,，立刻開始進(jìn)行膠體過濾，并收集各分劃,。請依循上述所有管柱及分劃收集器的操作要點(diǎn),。15） 收集所得的各分劃，進(jìn)行蛋白質(zhì)定量分析,，可定出數(shù)個(gè)蛋白質(zhì)尖峰,，以作為分子量依據(jù)；另以目測法,，決定紅色高峰的管數(shù),，則可定出vitamin B12的溶離管數(shù)。利用以上數(shù)據(jù),，可畫出分子量與溶離管數(shù)間的直線關(guān)系,，作為分子量判定的標(biāo)準(zhǔn)校正線。16） 同樣的一批分劃,，請進(jìn)行酶活性分析 （GUS）,，則可定出酶的溶離體積，對照上述標(biāo)準(zhǔn)校正線,，則可求出酶的分子量,。

拆除管柱及保存膠體：17） 若管柱長期不用，應(yīng)當(dāng)自管柱中取出膠體,，以緩沖液清洗后,，置冷藏室中保存，但不要放在冷凍箱中,。膠體若裝填太緊,，有時(shí)可能不易取出，要有耐心地以緩沖液慢慢沖出來,。18） 膠體可以加0.01% NaN3防止霉菌生長,，但使用前記得要洗去；再度使用時(shí),，請檢查膠體中有無灰黑色霉菌顆粒,，若有結(jié)塊而不易打散者,，也不要使用。

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