PCR反應在生物體外大量擴增特定DNA片段的分子生物學技術(shù),，其特點是可以以微量的DNA為模板,，快速擴增得到大量拷貝。

一,、PCR反應條件的控制：

1.  PCR反應的緩沖液提供合適的酸堿度與某些離子 ,。 

2.  鎂離子濃度 總量應比dNTPs的濃度高，常用1.5 mmol/L,。
　　
3.  底物濃度dNTP以等摩爾濃度配制,，20～200 umol/L。
　
4.  TaqDNA聚合酶2.5U(100 ul）,。
　　
5.  引物 濃度一般為0.1 ～0.5 umol/L。
　
6.  反應溫度
（1）變性溫度和時間95℃,，30 s,。
（2）退火溫度和時間 低于引物Tm值5 ℃左右，一般在45～55℃,。
（3）延伸溫度和時間72℃,，1 min/kb(10 kb內(nèi)）。
（4）Tm值=4(G+C) +2(A+T)
7.  循環(huán)次數(shù) ：一般為25 ～30次。循環(huán)數(shù)決定PCR擴增的產(chǎn)量,。模板初始濃度低,，可增加循環(huán)數(shù)以便達到有效的 擴增量。但循環(huán)數(shù)并不是可以無限增加的,。一般循環(huán)數(shù)為30個左右,，循環(huán)數(shù)超過30個以后，DNA聚合酶活性逐漸達到飽和,，產(chǎn)物的量不再隨循環(huán)數(shù)的增加而增加,，出現(xiàn)了所謂的“平臺期”。

二,、PCR的循環(huán)參數(shù)：
 
1.  預變性（Initial denaturation）

模板DNA全變性與PCR酶的全激活對PCR能否成功至關(guān)重要,，建議加熱時間參考試劑說明書，一般未修飾的Taq酶激活時間為兩分鐘,。

2.  循環(huán)中的變性步驟

循環(huán)中一般95℃,，30秒足以使各種靶DNA序列全變性，可能的情況下可 縮短該步驟時間,，變性時間過長損害酶活性,，過短靶序列變性不全，易造成擴增失敗,。

3.  引物退火（Primer annealing）

退火溫度需要從多方面去決定,，一般根據(jù)引物的Tm值為參考，根據(jù)擴增的長度適當下調(diào)作為退火溫度,。然后在此次實驗基礎(chǔ)上做出預估,。

退火溫度對PCR的特異性有較大影響。

4.  引物延伸

引物延伸一般在72℃進行（Taq酶最適溫度）,。但在擴增長度較短且退火溫度較高時,，本步驟可省略

延伸時間隨擴增片段長短而定，一般推薦在1000 bp以上,，含Pfu及其衍生物的衍生設(shè)定為1 min/kbp,。

5.  循環(huán)數(shù)

大多數(shù)PCR含25-40循環(huán)，過多易產(chǎn)生非特異擴增,。

6.  最后延伸

在最后一個循環(huán)后,，反應在72℃維持5-15分鐘．使引物延伸全，并使單鏈產(chǎn)物退火成雙鏈,。