一,、介紹

高壓液相色譜（HPLC）是分析化學(xué)和生物化學(xué)中常用的一種方法，用于將混合物中的化合物進(jìn)行分離,，以便進(jìn)一步分析和純化,。

在HPLC過程中,，混合物中的組分通過被泵送的溶劑（稱為流動(dòng)相）穿過裝有硅基顆粒的柱子（稱為固定相）來實(shí)現(xiàn)分離,。每種組分（稱為分析物）根據(jù)其在流動(dòng)相和固定相之間的獨(dú)牛寺親和力,，以不同的速度沿柱遷移，并在不同的時(shí)間從柱中流出,，從而實(shí)現(xiàn)混合物的有效分離,。

對(duì)流動(dòng)相具有較高親和力的分析物會(huì)沿著柱子遷移得更快，而對(duì)固定相具有較高親和力的分析物則遷移得更慢,。這種遷移時(shí)間（稱為保留時(shí)間）對(duì)于每個(gè)分析物都是獨(dú)牛寺的,，可以用于其鑒定。通過在柱后適當(dāng)使用檢測(cè)方法,，每個(gè)分析物也可以被定量分析,。

較小的柱填料顆粒尺寸可以提高色譜分辨率，但需要增加溶劑輸送壓力,。進(jìn)一步減小柱填料顆粒尺寸可以允許更高的溶劑流速,，從而在不犧牲分辨率的情況下減少分析時(shí)間。這正是超高效液相色譜（UHPLC）相對(duì)于其他液相色譜技術(shù)的優(yōu)勢(shì)所在,。

基本類型的高效液相色譜柱化學(xué)：

• 正相色譜,，例如硅膠顆粒

• 反相色譜,，例如涂有C-18的硅膠

基本的流動(dòng)相輸送系統(tǒng)類型：

• 等度洗脫 - 使用恒定溶劑混合物，例如在整個(gè)分離過程中使用10%的水在甲醇中,。

• 梯度洗脫 - 隨時(shí)間變化的溶劑混合物,，例如從純己烷開始，然后逐漸增加乙酸乙酯的濃度,，直到最后為純乙酸乙酯,。

高效液相色譜系統(tǒng)的基本組件包括溶劑輸送泵、樣品進(jìn)樣口,、柱子和檢測(cè)器,。高效液相色譜的性能要求儀器具有典型液相色譜系統(tǒng)所不具備的特性。溶劑輸送必須是無脈沖的,，并且在1毫升/分鐘到100微升/分鐘的流量范圍內(nèi)準(zhǔn)確校準(zhǔn),。

注射泵通常被認(rèn)為優(yōu)于活塞泵，適用于需要低且穩(wěn)定流速的高效液相色譜應(yīng)用,。Teledyne ISCO注射泵是這些高性能應(yīng)用的優(yōu)秀高效液相色譜泵,。

圖1：等度溶劑輸送系統(tǒng)

二、理論

Van Deemter方程是理解色譜法基本原理的關(guān)鍵,。根據(jù)Van Deemter方程：

H = A + B/µ + Cµ

其中：H是柱子的板高,，µ是流動(dòng)相的線性流速。A,、B和C是常數(shù),。較小的板高H表示更高的分離分辨率。²

常數(shù)A是渦流擴(kuò)散項(xiàng),。渦流擴(kuò)散是由于柱中多條流動(dòng)路徑導(dǎo)致的,，并且與流動(dòng)相流速無關(guān)。由于填料顆粒的存在,，分析物分子可以沿著不同長(zhǎng)度的多條路徑前進(jìn),。這些不同長(zhǎng)度的多重路徑使分析物分子分散開來，并導(dǎo)致峰展寬,。A項(xiàng)取決于固定相的緊密程度,。固定相中的空隙會(huì)因通道效應(yīng)導(dǎo)致峰展寬。相比之下,，較小的填料顆粒提供更小的路徑長(zhǎng)度差異,，從而減少峰展寬。

B是縱向擴(kuò)散系數(shù),。它依賴于分析物分子在流動(dòng)相中的擴(kuò)散系數(shù),。更快的流動(dòng)相流速減少了停留時(shí)間，而分析物分子在柱中的較短停留時(shí)間減少了縱向擴(kuò)散的影響,。這種減少有助于提高分離效率,，因?yàn)榉治鑫锓肿油ㄟ^擴(kuò)散散開的機(jī)會(huì)更少,，這解釋了1/v因子。

C是分析物質(zhì)量傳遞系數(shù),。它取決于分析物分子在移動(dòng)相和固定相之間達(dá)到平衡所需的時(shí)間,。如果這種平衡太慢，那么一些未能及時(shí)與固定相結(jié)合的分析物分子將會(huì)隨流動(dòng)相流下柱,；而那些未能及時(shí)從固定相脫離的其他分子則被留下,。更高的流動(dòng)相流速會(huì)導(dǎo)致分析物分子的擴(kuò)散，因此解釋了v因子,。較小的固定相顆粒預(yù)計(jì)會(huì)有更短的平衡時(shí)間,。

如上所述，較小的固定相顆?；蛑樽討?yīng)該會(huì)降低A和C值,。A項(xiàng)對(duì)H的貢獻(xiàn)較小，允許更高的分辨率,。隨著C項(xiàng)對(duì)H值的影響變得不那么顯著,，增加流動(dòng)相流速不會(huì)太多犧牲分離性能。這將允許在相同的分辨率下進(jìn)行更快的分離,。盡管較小的柱珠可能不會(huì)直接影響B值,，但較高的流速減少了其對(duì)H的貢獻(xiàn)。較小的柱珠將允許在更高分辨率下進(jìn)行更快的分離,。³

較小的珠子將以較小的間隙填充,，從而減小A值，但提供更高的溶劑流動(dòng)阻力,。反過來,，這需要更高的溶劑壓力。隨著蕞優(yōu)分離流速的增加,，柱背壓隨固定相顆粒尺寸的立方成反比增加,；即P∝1/d3。⁴通常,，對(duì)于5 µm柱珠的HPLC需要1,000 psi的壓力，而對(duì)于1.7 µm柱珠的UHPLC則需要20,000 psi或更高的壓力,。^1,4

圖2：梯度溶劑輸送系統(tǒng)

三,、HPLC泵

往復(fù)式泵通常配有單活塞或雙活塞?；钊麙哌^的體積通常較小,，約為100 µL。由于體積小,，需要頻繁補(bǔ)充液體,，導(dǎo)致周期性壓力下降,。雙活塞泵比單活塞泵產(chǎn)生更平穩(wěn)的流動(dòng)，但并非總是理想的選擇,。注射泵蕞適合要求高壓,、無脈沖和精確流動(dòng)的高性能應(yīng)用。注射泵具有更大的缸體容積,，高達(dá)1 L,，并且在運(yùn)行期間通常不需要重新填充。因此,，基線更加穩(wěn)定,，沒有周期性的壓力下降。理想的泵應(yīng)能夠在等度或梯度模式下操作,。

表1：常用推薦的HPLC泵

四,、引用

1) Y. Shen and R.D. Smith, Electrophoresis 23 (2002) pp. 3106-3124.

2) D.A. Skoog and D.M. West, Fundamentals of Analytical Chemistry, 3rd edit., pp. 643-649.

3) D. Sievers, M.E. Swartz and B.J. Murphy, G.I.T. Laboratory Journal 5(2004) pp.43-45.(2004) pp. 503-504

4) L.A. Colon, J.M. Cintron, J.A. Anspach, A.M. Fermier and K.A. Swin-ney, The Analyst 129

5) L.R. Snyder, J.J. Kirkland and J.L. Glajch, Practical HPLC Method Development, 2nd edit., pp. 41-43.

6) J.C. Giddings, Dynamics of Chromatography: Part I Principles and Theory (Marcel Dekker, Inc., New York: 1965) pp. 25-26, 229-230.

7) J.M. Cintron and L.A. Colon, The Analyst 127 (2002) pp. 701-704.A.D. Jerkovich, J.S. Mellors and J.W. Jorgenson, LCGC 21 (July 2003) pp. 600-611.