近年來有研究發(fā)現(xiàn),，納米顆粒的粗糙度對(duì)其性質(zhì)和功能有顯著的影響,，清晰的理解表面粗糙度對(duì)外部刺激的反應(yīng)和相互作用,，可以為預(yù)測納米顆粒在遞送,、分布等現(xiàn)象中的行為提供可靠信息,。因此獲得表面粗糙度信息對(duì)材料性能的研究具有重要的意義,。目前,，常通過光學(xué)顯微鏡和原子力顯微鏡測量這種特性,，但光學(xué)顯微鏡僅能在毫米尺度上定位納米顆粒的突起處,，AFM對(duì)表面不平整樣品的定位非常有挑戰(zhàn)性。

美國Quantum Design公司推出的AFM/SEM二合一顯微鏡FusionScope，將SEM,、AFM以及EDS等多種技術(shù)深度融合,，通過共享坐標(biāo)系，可提供AFM-SEM-EDS三位一體的原位相關(guān)解決方案,，輕松揭示來自同一目標(biāo)區(qū)域的不同特性,。其中樣品臺(tái)可以實(shí)現(xiàn)-10°-80°旋轉(zhuǎn)，為探針提供側(cè)向視野,，可視化記錄探針在樣品表面掃描的動(dòng)態(tài)過程,，排除一切不確定因素，為測試結(jié)果提供最直接的證據(jù),。

基于此,，美國Quantum Design公司利用AFM/SEM二合一顯微鏡FusionScope對(duì)表面形貌極為復(fù)雜的維生素C顆粒進(jìn)行了多維度、全面的研究,。首先,，借助FusionScope的SEM識(shí)別特定單個(gè)顆粒的能力，將懸臂尖精確引導(dǎo)至目標(biāo)區(qū)域,，同時(shí)利用側(cè)向視野觀察AFM的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)測量過程,，最后結(jié)合SEM成像、AFM形貌測量以及力-距離曲線分析,，獲取了單個(gè)顆粒的形態(tài),、表面粗糙度信息以及探針尖被顆粒污染的可能性，為增強(qiáng)顆粒研究和分析方法奠定了基礎(chǔ),。

本實(shí)驗(yàn)中,，研究者采用3.5kV低加速電壓，以消除SEM在掃描維生素C有機(jī)顆粒時(shí)產(chǎn)生的電荷積累,。FusionScope的SEM功能可以輕松識(shí)別和定位目標(biāo)維生素C顆粒（圖1a）,，可視化提供懸臂尖運(yùn)動(dòng)的實(shí)時(shí)狀態(tài)，自動(dòng)將AFM尖精準(zhǔn)導(dǎo)航至目標(biāo)區(qū)域,，側(cè)向視野可以直觀的觀察懸臂尖,，確保尖處于顆粒的預(yù)期位置（圖1b）。隨后,，在調(diào)幅模式下進(jìn)行高分辨率AFM成像（圖1c）,。觀測所得的SEM和AFM數(shù)據(jù)都可以在FusionScope軟件中相關(guān)聯(lián)，使數(shù)據(jù)分析變得簡單明了（圖1d）,。

圖1：通過FusionScope獲得SEM與AFM疊加圖像的流程,，(a)分辨目標(biāo)維生素C顆粒；（b）通過側(cè)向視野AFM探針置于目標(biāo)顆粒上方,；（c）掃描得到顆粒的高分辨AFM圖像,；(d)將兩個(gè)通道疊加,。

為了對(duì)維生素c顆粒進(jìn)行全表征，本工作中重點(diǎn)分析了3種不同形狀和大小的顆粒,，以評(píng)估它們的表面粗糙程度,。圖2中顯示了3個(gè)單獨(dú)顆粒的SEM正視圖，可以清晰分辨三組樣品的大小和結(jié)構(gòu),。

圖2：SEM 頂部視野中的三種不同形貌的維生素C顆粒,。

利用FusionScope的共享坐標(biāo)系，研究者將AFM尖無縫導(dǎo)航到每個(gè)獨(dú)立的顆粒表面,。樣品和探針尖的近正交視角進(jìn)一步促進(jìn)了精確定位,，特別是接近具有精細(xì)結(jié)構(gòu)的樣品時(shí)，如顆粒3,。

圖3：SEM側(cè)向視野中探針尖靠近3組樣品表面,。

圖4：振幅模式下記錄的AFM形貌掃描圖，3組顆粒的結(jié)果顯示如圖,，藍(lán)色框中顯示的是粗糙度測量范圍，粗糙度的結(jié)果從~600 nm（顆粒1）,，到420 nm（顆粒2）,，再到150 nm（顆粒3）不等。

圖5：(Top)高分辨的AFM形貌和相位圖像顯示出顆粒2的可能組成成分,。（Middle）AFM形貌與相圖的疊加圖案揭示在同一個(gè)結(jié)構(gòu)處二者具有不同的成分（Bottom）在ROS1和ROS2兩處的力曲線揭示材料具有不同的剛度和粘附性能,。

該樣品所有的力-距離曲線測試包括當(dāng)懸臂梁接近樣品表面（圖6（1））至與樣品接觸（2），到懸臂梁將顆粒向下推到底部（3）,，最后對(duì)顆粒進(jìn)行真正的機(jī)械力探測,，都是用SEM 在側(cè)向視野中觀察到的。紅色曲線表示的探針偏折其實(shí)是一種假象,，將力-距離測量與SEM側(cè)向視野相結(jié)合,，能夠避免這些誤導(dǎo)性的結(jié)果，并提供微小物體表面的力學(xué)性能的分析,。

側(cè)向視野中觀察到的傾斜樣品力學(xué)曲線測量動(dòng)態(tài)過程

圖6：SEM圖像顯示了在獲取力-距離曲線時(shí)懸臂梁的位置,，為了說明納米顆粒在力-距離曲線中的運(yùn)動(dòng)，在SEM 圖像中添加了水平虛線后,，將其分成了三個(gè)階段并獲得力曲線（a-c）,。圖6（1）和圖6（2）之間的力-距離曲線顯示懸臂在接觸顆粒之前的恒定偏折；另一方面,，在圖6（2）-（3）之間顯示了偏折量的增加,，該變化是由于探針將顆粒向下推到了表面；最后綠色曲線所示陡峭的力增長是由于納米顆粒定格至底部,，完整的力曲線如圖6d所示,。