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教你用熒光定量PCR儀,?(ABI 7500)

來源:北京固望生物科技有限公司   2024年12月04日 18:48  

打開電腦及儀器電源,,雙擊電腦桌面上的7500 software圖標(biāo)打開程序,。


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圖片來源:網(wǎng)絡(luò)


軟件主界面:


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圖片來源:7500/7500 Fast Real-Time PCR System GETTING STARTED GUIDE


實驗設(shè)置:


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a.實驗名稱

b.儀器型號

c.實驗?zāi)康模憾?、Genotyping(基因分型),、定性(有/無)


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d.定量類型:標(biāo)準(zhǔn)曲線,、相對標(biāo)準(zhǔn)曲線,、相對定量

e.實驗方法:探針法,、染料法

f.模板類型:gDNA、cDNA


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g.Target設(shè)置:Target包括目的基因,、內(nèi)參基因(多少個和名稱),。


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探針法需要選擇使用的熒光基團和淬滅基團。


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i.樣本設(shè)置:Sample包括實驗組,、對照組,、負(fù)對照組;樣本數(shù),、每樣本重復(fù)數(shù),、陰性對照數(shù)、樣本選擇和命名


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j.反應(yīng)孔的設(shè)置:根據(jù)樣品的排布選中面板上的加樣孔,,勾選左邊對應(yīng)的目的基因及模板,。


注意:不應(yīng)為了方便將所有孔選成同一個Target同一個Sample,這樣排布會造成比較大的風(fēng)險,。我們通過下面的例子進行說明

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圖片來源:qPCR進階攻略——帶你玩轉(zhuǎn)qPCR儀器設(shè)置,!-Yeasen


我們同一塊板上同時擴增兩個基因,而布孔時選成同一個Target,,那么儀器默認(rèn)的都是同一個閾值,,假如布孔時都選成Target1,紅色這條閾值線對于Target1是合理的,,但對于Target2則不合理,,因為這時已經(jīng)不在指數(shù)擴增期,得到的Ct值并不可信,。


反應(yīng)程序設(shè)置:PCR反應(yīng)程序的設(shè)置要根據(jù)不同公司的Master Mix,。比如BioTeke的95℃ 2分鐘就可以激活DNA聚合酶(ABI的需要10分鐘),。


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a.反應(yīng)體系設(shè)置


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反應(yīng)體系的配制,不得不說到參比/校正染料(reference dye,,passive dye),。常用的是ROX或者其他染料,只要不影響檢測PCR產(chǎn)物的熒光值就可以,。


參比染料的作用是標(biāo)準(zhǔn)化熒光定量反應(yīng)中的非PCR震蕩,,校正加樣誤差或者是孔與孔之間的誤差,提供一個穩(wěn)定的基線?,F(xiàn)在很多公司已經(jīng)把ROX配制在MasterMix或者Premixture里,,也有的是單獨分開。如果反應(yīng)曲線良好或已經(jīng)優(yōu)化好反應(yīng)體系,,也可以不加ROX染料校正,。比如Bio-RAD的系列儀器就不需要。


需要注意一點ABI儀器的需要加ROX參比染料的,,默認(rèn)的是ROX,,要根據(jù)不同公司的MasterMix進行這一個步驟的選擇。如BioTeke的MasterMix里沒有參比染料,,所以選擇“none”,。


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b.兩步法或三步法:qPCR反應(yīng)可以將退火與延伸兩步進行合并,條件需要根據(jù)引物和目的基因的長度進行調(diào)整,,根據(jù)qPCR引物設(shè)計原則,,引物的Tm值在60℃左右,因此這一步的溫度一般可設(shè)為60℃,。


c.熒光信號采集:對于染料法而言,,兩步法檢測的熒光信號采集應(yīng)該在退火延伸的整合步驟;三步法應(yīng)當(dāng)在72℃延伸時采集,,此時絕大部分的DNA是雙鏈狀態(tài),;Taqman法則一般在退火結(jié)束時或延伸結(jié)束采集信號。以ABI 7500為例,,選擇在哪一步采集熒光信號點亮其下面的小方塊即可,。


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d.熔解程序:使用染料法進行熒光定量PCR時,我們通常會在擴增階段完成后進行熔解曲線分析,,幫助確定產(chǎn)物類型,,判斷是否有非特異性擴增的產(chǎn)生。


以SYBR Green法為例,,SYBR Green染料只有結(jié)合到雙鏈DNA的小溝中才能發(fā)出熒光,,擴增反應(yīng)完成后,對產(chǎn)物逐漸升溫同時監(jiān)測每一步的熒光信號,,隨著溫度升高,,DNA雙鏈解開,,產(chǎn)物熒光信號下降。


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溶解曲線程序采用儀器默認(rèn)設(shè)置就可以,?;蛘呤莾x器說明書上建議的程序。溫度一般設(shè)置在60℃-95℃區(qū)間,,能包含產(chǎn)物Tm值和非特異產(chǎn)物Tm值即可,。在某個溫度下,雙鏈DNA會解鏈一半,,此后剩下的一半會迅速解鏈,,熒光驟降并形成變化的拐點,這個溫度稱為退火溫度(Tm值),。將溫度與熒光強度的變化求導(dǎo)作圖(-dI/dT),,從而生成熔解曲線。


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圖片來源:qPCR進階攻略——帶你玩轉(zhuǎn)qPCR儀器設(shè)置,!-Yeasen


RUN:全部設(shè)置好之后,,就可以把配置好的PCR管放進儀器,點擊RUN,!


數(shù)據(jù)分析:

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