打開電腦及儀器電源,,雙擊電腦桌面上的7500 software圖標(biāo)打開程序,。
圖片來源:網(wǎng)絡(luò)
軟件主界面:
圖片來源:7500/7500 Fast Real-Time PCR System GETTING STARTED GUIDE
實驗設(shè)置:
a.實驗名稱
b.儀器型號
c.實驗?zāi)康模憾?、Genotyping(基因分型),、定性(有/無)
d.定量類型:標(biāo)準(zhǔn)曲線,、相對標(biāo)準(zhǔn)曲線,、相對定量
e.實驗方法:探針法,、染料法
f.模板類型:gDNA、cDNA
g.Target設(shè)置:Target包括目的基因,、內(nèi)參基因(多少個和名稱),。
探針法需要選擇使用的熒光基團和淬滅基團。
i.樣本設(shè)置:Sample包括實驗組,、對照組,、負(fù)對照組;樣本數(shù),、每樣本重復(fù)數(shù),、陰性對照數(shù)、樣本選擇和命名
j.反應(yīng)孔的設(shè)置:根據(jù)樣品的排布選中面板上的加樣孔,,勾選左邊對應(yīng)的目的基因及模板,。
注意:不應(yīng)為了方便將所有孔選成同一個Target同一個Sample,這樣排布會造成比較大的風(fēng)險,。我們通過下面的例子進行說明
圖片來源:qPCR進階攻略——帶你玩轉(zhuǎn)qPCR儀器設(shè)置,!-Yeasen
我們同一塊板上同時擴增兩個基因,而布孔時選成同一個Target,,那么儀器默認(rèn)的都是同一個閾值,,假如布孔時都選成Target1,紅色這條閾值線對于Target1是合理的,,但對于Target2則不合理,,因為這時已經(jīng)不在指數(shù)擴增期,得到的Ct值并不可信,。
反應(yīng)程序設(shè)置:PCR反應(yīng)程序的設(shè)置要根據(jù)不同公司的Master Mix,。比如BioTeke的95℃ 2分鐘就可以激活DNA聚合酶(ABI的需要10分鐘),。
a.反應(yīng)體系設(shè)置
反應(yīng)體系的配制,不得不說到參比/校正染料(reference dye,,passive dye),。常用的是ROX或者其他染料,只要不影響檢測PCR產(chǎn)物的熒光值就可以,。
參比染料的作用是標(biāo)準(zhǔn)化熒光定量反應(yīng)中的非PCR震蕩,,校正加樣誤差或者是孔與孔之間的誤差,提供一個穩(wěn)定的基線?,F(xiàn)在很多公司已經(jīng)把ROX配制在MasterMix或者Premixture里,,也有的是單獨分開。如果反應(yīng)曲線良好或已經(jīng)優(yōu)化好反應(yīng)體系,,也可以不加ROX染料校正,。比如Bio-RAD的系列儀器就不需要。
需要注意一點ABI儀器的需要加ROX參比染料的,,默認(rèn)的是ROX,,要根據(jù)不同公司的MasterMix進行這一個步驟的選擇。如BioTeke的MasterMix里沒有參比染料,,所以選擇“none”,。
b.兩步法或三步法:qPCR反應(yīng)可以將退火與延伸兩步進行合并,條件需要根據(jù)引物和目的基因的長度進行調(diào)整,,根據(jù)qPCR引物設(shè)計原則,,引物的Tm值在60℃左右,因此這一步的溫度一般可設(shè)為60℃,。
c.熒光信號采集:對于染料法而言,,兩步法檢測的熒光信號采集應(yīng)該在退火延伸的整合步驟;三步法應(yīng)當(dāng)在72℃延伸時采集,,此時絕大部分的DNA是雙鏈狀態(tài),;Taqman法則一般在退火結(jié)束時或延伸結(jié)束采集信號。以ABI 7500為例,,選擇在哪一步采集熒光信號點亮其下面的小方塊即可,。
d.熔解程序:使用染料法進行熒光定量PCR時,我們通常會在擴增階段完成后進行熔解曲線分析,,幫助確定產(chǎn)物類型,,判斷是否有非特異性擴增的產(chǎn)生。
以SYBR Green法為例,,SYBR Green染料只有結(jié)合到雙鏈DNA的小溝中才能發(fā)出熒光,,擴增反應(yīng)完成后,對產(chǎn)物逐漸升溫同時監(jiān)測每一步的熒光信號,,隨著溫度升高,,DNA雙鏈解開,,產(chǎn)物熒光信號下降。
溶解曲線程序采用儀器默認(rèn)設(shè)置就可以,?;蛘呤莾x器說明書上建議的程序。溫度一般設(shè)置在60℃-95℃區(qū)間,,能包含產(chǎn)物Tm值和非特異產(chǎn)物Tm值即可,。在某個溫度下,雙鏈DNA會解鏈一半,,此后剩下的一半會迅速解鏈,,熒光驟降并形成變化的拐點,這個溫度稱為退火溫度(Tm值),。將溫度與熒光強度的變化求導(dǎo)作圖(-dI/dT),,從而生成熔解曲線。
圖片來源:qPCR進階攻略——帶你玩轉(zhuǎn)qPCR儀器設(shè)置,!-Yeasen
RUN:全部設(shè)置好之后,,就可以把配置好的PCR管放進儀器,點擊RUN,!
數(shù)據(jù)分析:
免責(zé)聲明:轉(zhuǎn)發(fā)自分子莊園公眾號,若有侵權(quán),,請聯(lián)系刪除,,若要轉(zhuǎn)載請注明出處。
相關(guān)產(chǎn)品
免責(zé)聲明
- 凡本網(wǎng)注明“來源:化工儀器網(wǎng)”的所有作品,,均為浙江興旺寶明通網(wǎng)絡(luò)有限公司-化工儀器網(wǎng)合法擁有版權(quán)或有權(quán)使用的作品,,未經(jīng)本網(wǎng)授權(quán)不得轉(zhuǎn)載、摘編或利用其它方式使用上述作品,。已經(jīng)本網(wǎng)授權(quán)使用作品的,,應(yīng)在授權(quán)范圍內(nèi)使用,并注明“來源:化工儀器網(wǎng)”,。違反上述聲明者,,本網(wǎng)將追究其相關(guān)法律責(zé)任。
- 本網(wǎng)轉(zhuǎn)載并注明自其他來源(非化工儀器網(wǎng))的作品,,目的在于傳遞更多信息,,并不代表本網(wǎng)贊同其觀點和對其真實性負(fù)責(zé),不承擔(dān)此類作品侵權(quán)行為的直接責(zé)任及連帶責(zé)任,。其他媒體,、網(wǎng)站或個人從本網(wǎng)轉(zhuǎn)載時,必須保留本網(wǎng)注明的作品第一來源,,并自負(fù)版權(quán)等法律責(zé)任,。
- 如涉及作品內(nèi)容,、版權(quán)等問題,請在作品發(fā)表之日起一周內(nèi)與本網(wǎng)聯(lián)系,,否則視為放棄相關(guān)權(quán)利,。