細(xì)胞培養(yǎng)的傳代及日常維持過程中,，在培養(yǎng)器具,、培養(yǎng)液及各種準(zhǔn)備工作方面都需大量的耗費(fèi),，而且細(xì)胞一旦離開活體開始原代培養(yǎng),，它的各種生物特性都將逐漸發(fā)生變化并隨著傳代次數(shù)的增加和體外環(huán)境條件的變化而不斷有新的變化,。因此及時(shí)進(jìn)行細(xì)胞凍存十分必要,。細(xì)胞冷凍儲(chǔ)存在-70℃冰箱中可以保存一年之久,；細(xì)胞儲(chǔ)存在液氮中,，溫度達(dá)-196℃,，理論上儲(chǔ)存時(shí)間是無限的。

一,、實(shí)驗(yàn)原理：

隨著溫度降低,，細(xì)胞內(nèi)的酶活性會(huì)逐漸降低，到-70℃左右,，酶活性幾乎為0,，代謝活動(dòng)停止，可以實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期保存,。然而,，隨著溫度降低，細(xì)胞內(nèi)外的水分也會(huì)“結(jié)冰”并形成冰晶,，冰晶能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)發(fā)生機(jī)械損傷,、電解質(zhì)升高、滲透壓改變,、脫水,、pH改變、蛋白變性等,，能引起細(xì)胞死亡,。因此常加入冷凍保護(hù)劑甘油或二甲基亞砜（DMSO）。DMSO能快速穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞,，降低冰點(diǎn),，延緩凍存過程，同時(shí)增加細(xì)胞膜的通透性,，提高細(xì)胞內(nèi)離子濃度,，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的目的,。

二,、實(shí)驗(yàn)步驟

1. 制備凍存液，凍存液比例：本實(shí)驗(yàn)室采用70%基礎(chǔ)培養(yǎng)基+20%FBS+10%DMSO,，不同實(shí)驗(yàn)室及不同細(xì)胞可能略有差異,，也可采用55%基礎(chǔ)培養(yǎng)基+40%FBS+5%DMSO；

2. 取形態(tài)良好,，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,，對(duì)其消化、離心 (1500rpm離心8min),、計(jì)數(shù),；

3. 根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入對(duì)應(yīng)的凍存液，使細(xì)胞密度維持在300-500w/mL,；

4. 小心用鑷子打開凍存管管蓋,，每管分裝1-1.5mL含細(xì)胞的凍存液,，擰緊蓋管，做好標(biāo)記,。

5. 分裝好的凍存管轉(zhuǎn)入程序降溫盒后直接放-80℃過夜,；

6. 若沒有程序降溫盒，則按下列順序依次降溫：室溫→4℃20min→-20℃30min→-80℃過夜,，注意轉(zhuǎn)移過程中要保冷,，避免產(chǎn)生溫差或凍存管融化；

7. 從-80℃冰箱取出凍存管迅速轉(zhuǎn)移到液氮長(zhǎng)期保存,。

三,、注意事項(xiàng)：

1. 為保持細(xì)胞最大存活率，一般都采用慢凍存融的方法,。

2. 凍存物距液氮面越近溫度越低,。標(biāo)準(zhǔn)的低凍速度為－1℃~12℃/分鐘，當(dāng)溫度下降達(dá)－25℃時(shí),，下降速度可增至－5~－10℃/分鐘,，到－100℃時(shí)則可迅速凍入液氮中。因此要適當(dāng)掌握凍存物下降入液氮中的速度,，過快能影響細(xì)胞內(nèi)水分透出,，太慢則促冰晶形成。

3. 初次凍存者在下降凍存時(shí),，宜先用細(xì)木棒伸入罐中探測(cè)液面位置,，然后需用溫度計(jì)與凍存物并行的辦法，以觀測(cè)下降凍存物的速度,、凍存物與液氮液面距離和溫度三者關(guān)系,，當(dāng)已掌握以上各參數(shù)和凍存技術(shù)熟練后，僅按下降時(shí)間和下降距離便可獲理想凍存效果,。

4. 各種細(xì)胞對(duì)凍存速度的要求也不一樣,；上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞耐受性可能大些，骨髓干細(xì)胞－2~－3℃/分鐘合適,；胚胎細(xì)胞耐受性較小，不宜太快,?？傊谝婚_始時(shí)，下降速度不能超過－10℃/分鐘,。

5. 用什么防護(hù)劑合適和用量多大,，要依細(xì)胞而定，初代培養(yǎng)細(xì)胞用DMSO 較好,，一般細(xì)胞可用甘油,；用量以較小為好,。有人認(rèn)為人皮膚上皮細(xì)胞貯存在20%-30%甘油中很好。

6. 原則上細(xì)胞在液氮中可貯存多年,，但為妥善起見,，凍存一年后，應(yīng)再復(fù)蘇培養(yǎng)一次,，然后再繼續(xù)凍存,。

7. 將凍存管放入液氮容器或從中取出時(shí)，要做好防護(hù)工作,，以免凍傷

8. 注意自身的安全,，對(duì)于來自人源性或病毒感染的細(xì)胞株應(yīng)特別小心。操作過程中,，應(yīng)避免引起氣溶膠的產(chǎn)生,，小心有毒性試劑例如DMSO，并避免尖銳物品傷人等,。