手機版
化工儀器網手機版
化工儀器網小程序
官方微信
公眾號：chem17
掃碼關注視頻號
八聚體錐形孔跨膜蛋白——MspA蛋白
恥垢分枝桿菌毒素蛋白（Mycobacterium smegmatisporin A, MspA）是一種通道形成蛋白，用于小分子和水的通道,。MspA是分子量 20 kDa 的單體蛋白構建的同源性八聚體,，其形狀為“八”字形杯狀結構。MspA長度大約 1 nm,，具有大約1 nm的寬度收縮區(qū),，兩側有明顯較大的直徑區(qū)域。
MspA 擁有很好的化學穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性,，在 100℃的溫度下活性能耐受 30 min,，在80℃的2% SDS條件中培養(yǎng)15分鐘依然可以保持良好的通道活性，在 pH 0~14 的范圍內保持穩(wěn)定,，同時MspA具有易于進行多位點突變修飾,。
圖1 MspA突變體的結構與表達
MspA是一種納米孔分析的理想材料
MspA 的幾何形狀可以提供很好的空間分辨率，因為離子電流阻塞的特征主要是由穿過孔隙狹窄區(qū)域的多核苷酸片段決定的,。另外,，MspA 擁有很好的化學穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性，最后，MspA可以為多種氨基酸替代保留高水平表達和通道活性,，是一種通過定點誘變進行工程設計的理想選擇,。近年來，MspA蛋白在單分子檢測領域的研究和應用得到越來越多關注,，MspA蛋白納米孔最重要的應用集中在DNA測序方面,，主要用于檢測表征ssDNA。
圖2 納米孔測序原理
MspA在生物和醫(yī)學展現(xiàn)應用潛力
MspA作為一種具有錐形結構的八聚體孔道蛋白,，通過引入突變開發(fā)工程化MspA孔道,，可以實現(xiàn)多種單糖直接區(qū)分，說明MspA是核酸與多種生物大分子檢測的有力品,。
MspA是細菌細胞外膜上親水性營養(yǎng)溶質的主要通道,，負電性密集的收縮區(qū)具有天冬氨酸的雙圈結構，能夠與陽離子結合,。使用合適的通道阻斷劑可以堵塞MspA蛋白孔,，則親水性營養(yǎng)溶質不能輸送進細菌體內，造成細菌休眠,，同時可以破壞細胞外壁的穩(wěn)定性,，增強細菌的抗生素易感性，對于疾病治療具有重要作用,。
圖3 MspA實現(xiàn)單糖區(qū)分
珀羅汀基于無細胞體系成功表達MspA八聚體跨膜蛋白
客戶案例
收到MspA序列后,，珀羅汀構建融合了GFP的線性化表達模版，隨后,，采用自主研發(fā)的PLD無細胞蛋白表達試劑盒（膜蛋白（或困難蛋白）表達增強版,，#PLDK002）進行蛋白合成，蛋白合成后采用9種方案進行合適的表面活性劑篩選,，對于目的蛋白的表達結果采用SDS-PAGE進行鑒定,。
圖4 目的蛋白表達鑒定
（channel 1：空白對照；channel 2~10：不同方案的目的膜蛋白表達情況,；channel 11：marker）
之后,，選擇PLDK002-C（channel 3）和PLDK002-I（channel 9） 的無細胞蛋白表達體系進行第二輪優(yōu)化。優(yōu)化結果顯示,，channel 5的無細胞蛋白表達方案可以正確表達該MspA的單體與多聚體,。
圖5 MspA目的蛋白表達鑒定
客戶評價
這次選擇比較新穎的無細胞蛋白表達體系進行MspA表達，珀羅汀僅用4天完成小試,，相當快速,，膠圖結果中單體和多聚體的亞基都是對的。相比于細胞表達體系,，無細胞體系可以輕松實現(xiàn)多亞基膜蛋白表達及正確組裝的難題,。對于復雜多亞基超結構膜蛋白的結構研究和物理,、化學、生物性質研究而言,，這無疑是巨大的福音,。
珀羅汀推薦
CFPS膜蛋白表達純化服務！
不表達不收費,！
Tom Z, Mikhail P,et al.Single-molecule DNA detection with an engineered MspA protein nanopore. PNAS,doi 10.1073 (2008).
SY Zhang,ZY Cao,et al.A Nanopore-Based Saccharide Sensor. Angew.Chem. Int.Ed.doi.org/10.1002/anie.202203769 (2022).
Ayomi S. Perera,et al. Channel Blocking of MspA Revisited. Langmuir.doi.org/10.1021/la3037296 (2012).
免責聲明
- 凡本網注明“來源：化工儀器網”的所有作品,，均為浙江興旺寶明通網絡有限公司-化工儀器網合法擁有版權或有權使用的作品，未經本網授權不得轉載,、摘編或利用其它方式使用上述作品,。已經本網授權使用作品的，應在授權范圍內使用,，并注明“來源：化工儀器網”,。違反上述聲明者，本網將追究其相關法律責任,。
- 本網轉載并注明自其他來源（非化工儀器網）的作品,，目的在于傳遞更多信息，并不代表本網贊同其觀點和對其真實性負責,，不承擔此類作品侵權行為的直接責任及連帶責任,。其他媒體,、網站或個人從本網轉載時,，必須保留本網注明的作品第一來源，并自負版權等法律責任,。
- 如涉及作品內容,、版權等問題，請在作品發(fā)表之日起一周內與本網聯(lián)系,，否則視為放棄相關權利,。
采購中心