1.脫蠟水化,。將石蠟切片置于新鮮二甲苯脫中浸泡 15 分鐘,重復三次。去除多余的液體后,依次置于無水乙醇,、95%乙醇,、90%乙醇,、80%乙醇、70%乙醇,各浸泡 5 分鐘,蒸餾水(或自來水)沖洗 5 分鐘,。用 PBS 緩沖液(試劑 1,將干粉溶解于 1L 去離子水中)沖洗切片 5 分鐘,重復三次,。

2.抗原修復。將脫蠟水化后的組織切片置于燒杯(或修復盒)中的耐高溫塑料切片架上,加適量修復液 1× 檸檬酸鈉抗原修復液(試劑 2,將 100×檸檬酸鈉抗原修復液加去離子水稀釋成 1×檸檬酸鈉抗原修復液),液面要浸過切片組織一定高度,將修復盒置于沸水中煮沸修復 15 分鐘后取出玻片,自然涼至室溫,。用 PBS 緩沖液沖洗切片 5 分鐘,重復三次,。

注意:抗原修復時,修復液務必保證切片始終浸泡在液體內(nèi),一般情況:修復液的量約為 800mL/1 架。

3.阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,。用吸水紙擦干玻片,免疫組化筆在組織周圍畫圈,滴加 50μL 內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑(試劑 3)到切片組織上以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,室溫孵育 30 分鐘,用 PBS 緩沖液沖洗切片 5 分鐘,重復三次,。

4.血清封閉。用吸水紙擦干玻片,滴加 50μL 正常山羊血清工作液(試劑 5),37℃封閉 20 分鐘,以減少非特異性染色,。

5.一抗孵育,。用抗體稀釋液(試劑 4)將一抗原液稀釋成工作液,用吸水紙擦干玻片組織周圍的液體,滴加適量抗體工作液,置于濕盒 4℃孵育過夜或 37℃孵育 1h-2h。

6.復溫,。4℃過夜后從冰箱拿出樣本,在室溫下孵育 15min 復溫(抗體孵育為 4℃過夜選用此步驟,如室溫孵育直接進入下一步清洗),。用 PBS 緩沖液沖洗切片 5 分鐘,重復三次。

7.二抗孵育,。吸水紙擦干切片后滴加 50μL 生物素標記的羊抗兔 IgG(試劑 6),37℃孵育 20  分鐘,用 PBS緩沖液沖洗切片 5 分鐘,重復三次,。

8.三抗孵育。吸水紙擦干切片后滴加 50μL 辣根酶標記的鏈酶卵白素孵育(試劑 7),37℃孵育 20  分鐘,用 PBS 緩沖液沖洗切片 5 分鐘,重復三次,。

9.顯色,。甩去 PBS 緩沖液,吸水紙擦干切片; 每張切片滴加新鮮配制的 DAB 工作液 50μL(試劑 8:試劑 9:試劑 1=1:1:18  比例配置),孵育 3-5min,光學顯微鏡下觀察染色結果,切勿顯色過深;顯色后用自來水沖洗切片終止顯色。

10.復染,。滴加適量蘇木素染液(試劑 10)復染,孵育 1-5 分鐘,自來水沖洗 5 分鐘,滴加鹽酸酒精分化液分化 30 秒,自來水沖洗,。

11.脫水封片。將玻片依次置于 70%乙醇,、80%乙醇,、90%乙醇、95%乙醇,、無水乙醇,各浸泡 5 分鐘, 再將玻片放入二甲苯中浸泡 15 分鐘,重復三次,。玻片取出來稍晾干,用中性樹膠封片。