瓊脂具有特殊的溶點(diǎn)和凝固點(diǎn),，所含成分很難被微生物分解利用且不含抑制性成分,，因此很適用于微生物培養(yǎng)基的制備，從而作為固體培養(yǎng)基最chang用的凝固劑,，到目前為止,，在這方面世界上還沒(méi)有一種能夠替代瓊脂的代用品,。

  一些初期從事植物組織培養(yǎng)工作或微生物培養(yǎng)的人員，尤其是初學(xué)者,，在配制培養(yǎng)基時(shí)往往會(huì)遇到培養(yǎng)基難以正常凝固的現(xiàn)象：或呈半流體,、或wanquan呈液體狀態(tài)、同時(shí)還會(huì)現(xiàn)出各種顏色,。本文將對(duì)瓊脂的凝固性以及影響其凝固性的關(guān)鍵因素作系統(tǒng)的介紹,，并針對(duì)不同的操作方法進(jìn)行問(wèn)答式評(píng)價(jià)，以期能幫助更多的人解決實(shí)際工作中的相關(guān)問(wèn)題,，少走彎路,。

一、有關(guān)瓊脂的知識(shí)

  瓊脂,，又名瓊膠或凍粉,，因最初從日本海藻中提取，故又稱“洋菜”,。瓊脂成品為白色或淡黃色粉末狀或細(xì)條形,，主要是由復(fù)雜的大分子多糖類物質(zhì)組成,。其水解物的組成有40%的D-半乳糖,、3%硫酸酯和2%丙酮酸，實(shí)際上,，它是瓊脂膠和瓊脂糖兩種成分的混合物,。瓊脂膠是瓊脂糖的硫酸酯，瓊脂糖主要依靠氫鍵的引力形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),。因此,，瓊脂糖凝膠的穩(wěn)定性比那些以化學(xué)鍵交聯(lián)而形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝固劑的穩(wěn)定性要差一些。

  瓊脂溶于熱水而不溶于冷水,，因此在配制培養(yǎng)基時(shí)需煮制瓊脂,。隨著溫度的升高，瓊脂逐漸溶解,，當(dāng)溫度下降到40℃時(shí)則開(kāi)始凝固,。配制培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)注意，由于各地生產(chǎn)的瓊脂的質(zhì)量不同,，同樣濃度的瓊脂水溶液凝固后在硬度,、透明度及色澤上會(huì)有所差異。劣質(zhì)瓊脂不僅凝固性差,，而且?guī)в泻芏嚯s質(zhì),。

二、有關(guān)瓊脂凝固性的知識(shí)

  作為培養(yǎng)基的凝固劑,，瓊脂的凝固性除與瓊脂本身的品質(zhì)有關(guān)外,，還會(huì)受到滅菌溫度,、滅菌時(shí)間、瓊脂量和pH值的影響,。

  （1）0.7%～0.8%的瓊脂水溶液在冷卻后會(huì)很好凝固,，對(duì)于常用的微生物培養(yǎng)基，瓊脂的用量基本趨于穩(wěn)定,，通常條狀瓊脂的用量約為2%,，粉狀瓊脂的用量為1%～1.5%。

  （2）培養(yǎng)基的酸堿度對(duì)瓊脂的凝固性影響很大,，是瓊脂在正常濃度范圍內(nèi)能否凝固的關(guān)鍵因素,，當(dāng)4.30<ph<10.05時(shí)，瓊脂水溶液均可正常凝固,，超過(guò)此范圍,，瓊脂的凝固性變差，培養(yǎng)基不能正常凝固,。< span="">

  （3）在4.30<ph<10.05范圍內(nèi),，瓊脂的凝固性受高溫高壓(1.1 kg="" cm<="" span="">²，120℃)的影響很小,，延長(zhǎng)高溫高壓滅菌時(shí)間或反復(fù)高溫高壓處理均不會(huì)影響其凝固性,。pH較高(5.0-8.0)時(shí)，瓊脂濃度是影響凝固等級(jí)的主要因素,。

<ph<10.05范圍內(nèi),，瓊脂的凝固性受高溫高壓(1.1kg cm

  （4）當(dāng)配制的固體培養(yǎng)基pH低于3.44時(shí)，其凝固性會(huì)受到滅菌溫度,、滅菌時(shí)間,、瓊脂量和pH值的影響。其中滅菌溫度,、滅菌時(shí)間與瓊脂凝固性呈負(fù)相關(guān),，瓊脂量、pH值與瓊脂凝固性呈正相關(guān),。但在這些因素中,，瓊脂量的影響不是很大，因此在該類培養(yǎng)基的滅菌過(guò)程中應(yīng)該重點(diǎn)把握好滅菌溫度,、滅菌時(shí)間和pH值,。使用較低的滅菌溫度，較短的滅菌時(shí)間,，適當(dāng)?shù)卦黾优囵B(yǎng)基的pH值就可以顯著提高瓊脂的凝固性,。pH較低(≤4.0)時(shí)，pH是影響凝固等級(jí)的主要因素,。

三,、案例分析

  基于實(shí)驗(yàn)得出的理論知識(shí),，大家都比較好理解和接受，但在實(shí)際操作過(guò)程中,，經(jīng)常會(huì)有人碰到瓊脂不能凝固的情況（如圖1）,，下面針對(duì)具體案例進(jìn)行分析討論：

圖1 滅菌后的培養(yǎng)基出現(xiàn)分層現(xiàn)象

案例一

  問(wèn)：我使用的是**生產(chǎn)的瓊脂，用冷水就能溶解了,，高壓蒸汽滅菌后就能使用了,，最近在倒平板時(shí)，發(fā)現(xiàn)有幾塊怎么也不凝固,，同一瓶子里的瓊脂只有幾塊不凝固,，我專門放到第2天發(fā)現(xiàn)還是稀呼呼的。

  答：首先糾正一下,，您說(shuō)用冷水就能溶解了,，這肯定不對(duì)：瓊脂溶于熱水而不溶于冷水，將瓊脂放在冷水中,，充其量只能是把瓊脂浸濕了泡軟了,，根本達(dá)不到溶解的程度，也就談不上均勻地分散在培養(yǎng)基溶液中了,。既然分散不均勻,，滅菌后倒出的平板，就容易產(chǎn)生瓊脂含量不一的結(jié)果,，表現(xiàn)出來(lái)的現(xiàn)象就是您所描述的,，同一瓶子里的瓊脂,，有幾塊怎么也不凝固,，即使放到第2天或更多天，也不會(huì)凝固,，因?yàn)槔锩娴沫傊亢苌侔?，達(dá)不到凝固的要求，即使放再多時(shí)間結(jié)果也是一樣,。

  問(wèn)：必須要wanquan煮化嗎,？

  答：瓊脂必須煮沸，常溫下是溶解不了的,，只有煮沸后再冷卻才會(huì)凝固,。

  問(wèn)：夏天溫度高的時(shí)候是不是就不用煮沸了？

  答：配好培養(yǎng)基后,，一定要加熱攪拌溶解,。培養(yǎng)基外包裝標(biāo)簽上說(shuō)得很清楚，要加熱煮沸至wanquan溶解,，夏天溫度再高也不會(huì)超過(guò)50度吧,？所以天氣熱了也要這么做,，使得培養(yǎng)基中各成分混合均勻。步驟不要省略?。,。?/span>

  問(wèn)：那我們以前都是同樣的操作,，怎么都好著呢？

  答：正確的培養(yǎng)基配制方法應(yīng)該是先將含瓊脂培養(yǎng)基煮沸至wanquan溶解之后,，再分裝入三角瓶中進(jìn)行滅菌,，并且滅菌完畢從鍋里拿出來(lái)后，要及時(shí)搖一搖三角瓶（用力搖）,，使滅菌后的培養(yǎng)基中瓊脂能夠均勻分散在里面,，然后再傾倒平皿。你之前沒(méi)出問(wèn)題,，不代表你的操作就是合乎要求的,，你不按照正規(guī)的方法操作，遲早會(huì)出問(wèn)題的,，這不就被你碰到了嗎,？

  另外，即使滅菌前沒(méi)有先煮沸再分裝滅菌,，只在滅菌完畢,，開(kāi)鍋后第一時(shí)間將瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)基搖勻，也就不會(huì)出現(xiàn)你碰到的問(wèn)題了,。

  這里需要注意,，搖勻，一定是用力搖勻,，而不是隨手輕輕一晃就行了,。

  問(wèn)：為何還要搖啊,？你在煮沸,、滅菌時(shí)，不就自然勻了嗎,？

  答：滅菌時(shí)能自然勻了,？這也是你自己認(rèn)為的吧？當(dāng)然很多人都會(huì)這么認(rèn)為,。熬粥的時(shí)候滿鍋里都沸騰,，稍放置一會(huì)兒，鍋底的粥是不是要稠一些？大同小異,！

  問(wèn)：可是滅菌后搖晃容易產(chǎn)生氣泡?。?/strong>

  答：開(kāi)鍋拿出來(lái)后手搖幾下就勻了,，少量氣泡稍微靜置就會(huì)消掉的,，或者放到水浴鍋里恒溫到50度的時(shí)候一般就沒(méi)有氣泡了。臨倒平板前就不要搖了,！那時(shí)候再搖,，氣泡可能就不容易消掉了。

  問(wèn)：那我怎么搖勻,？我用500mL的三角瓶配500mL培養(yǎng)基,，根本搖不起來(lái)！

  答：?jiǎn)栴}就出來(lái)這里,，做微生物實(shí)驗(yàn),，將配好的培養(yǎng)基分裝到適當(dāng)容器中，培養(yǎng)基體積不應(yīng)超過(guò)容器容積的2/3(可參考GB 4789.28食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求),。也就是說(shuō)不要將瓶子里裝得滿滿當(dāng)當(dāng)?shù)?，這樣很容易導(dǎo)致瓊脂沉在下面，不容易搖勻,。

  我們平時(shí)做實(shí)驗(yàn),，配500mL培養(yǎng)基用1000mL的瓶子，配200mL培養(yǎng)基用500mL瓶子,，500mL的瓶子里最多裝400mL培養(yǎng)基的,，你比較看看你的裝量。

  問(wèn)：我們一直都這么配制的,，只是最近的出了問(wèn)題,，同一瓶培養(yǎng)基，只有幾個(gè)板這樣的,。

  答：培養(yǎng)基的標(biāo)簽上有明確的用法：稱23.5 g于1 L蒸餾水中,，加熱煮沸wanquan溶解，121攝氏度滅菌15分鐘,，冷卻至46攝氏度左右備用。

  對(duì)比上面的解答,，看看你們一直以來(lái)的操作有哪些問(wèn)題吧,，然后按照正規(guī)的操作要求再堅(jiān)持一段時(shí)間，再出現(xiàn)同樣的問(wèn)題再來(lái)找我好吧,？(不搖勻的情況下,，同一瓶培養(yǎng)基倒出的平板強(qiáng)度差異很大，可參考附錄表格),。

案例二

  問(wèn)：配制的是營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,，都是按照上面說(shuō)的配制的,，滅菌后放入冰箱怎么也不能wanquan凝固，在底部還有非常硬的像膠皮一樣的胨,。請(qǐng)幫忙看看到底是怎么回事,。

  答：有沒(méi)有想過(guò)最底部的非常硬的膠皮一樣的東西是什么？那就是相對(duì)很濃的瓊脂液冷卻形成的,。如果把這一部分瓊脂趁熱搖勻,，使其均勻分散在整瓶培養(yǎng)基里面呢？是不是上面就沒(méi)那么稀了,，能凝固了,，下面也沒(méi)那么稠了，硬度合適了,。也就是說(shuō)搖勻后倒平皿,，整瓶培養(yǎng)基都能用了。

  你滅菌后沒(méi)經(jīng)過(guò)搖勻,，瓊脂本來(lái)就沉積在瓶底,，直接放入冰箱，瓶底迅速冷卻,，大量的瓊脂就先凝固了,，瓶子上面的部分含瓊脂就很少了，所以才會(huì)不凝固,。不管放多久都不會(huì)改善?。?/span>

  問(wèn)：聽(tīng)說(shuō)瓊脂太酸也不會(huì)凝固,，是不是我們使用的培養(yǎng)基pH不合格?。?/strong>

  答：pH合格不合格,，你測(cè)一下不就知道了,。在pH 5-10之間，pH對(duì)瓊脂的凝固性影響并沒(méi)有那么大,。你用的都是常規(guī)培養(yǎng)基,，pH怎么可能那么低嘛。另外,，如果是pH值太低的話,，加熱以后瓊脂會(huì)變性，底部就不會(huì)有凝固的瓊脂硬塊了,，而會(huì)成一瓶糊糊,。你這顯然是瓊脂混合不均勻引起的，使用前用微波溶化，晃一晃就好了,。

  問(wèn)：用兩個(gè)大燒杯把融化了的培養(yǎng)基來(lái)回傾倒混勻,，然后倒皿，效果不錯(cuò),。

  答：道理是一樣的,，就是為了使瓊脂混合均勻。但這種操作方法有點(diǎn)繁瑣,，并且容易染菌,，不提倡。

  問(wèn)：像我這種情況,，培養(yǎng)基還能用嗎,？

  答：能用！重新水浴加熱,，讓其wanquan溶解后,，搖勻，傾倒平板即可,?；蛘哂梦⒉訜幔⒁怆S時(shí)觀察,，經(jīng)常拿出來(lái)?yè)u一搖,，以免培養(yǎng)基噴出。

  問(wèn)：培養(yǎng)基可以多次這樣反復(fù)融化使用嗎,？

  答：不建議,！如果不是不得已，建議現(xiàn)滅現(xiàn)用,。

案例三

  問(wèn)：今天分別用了伊紅美藍(lán)瓊脂和營(yíng)養(yǎng)瓊脂兩種培養(yǎng)基做斜面,，然而滅菌后做斜面都不凝固，這是為啥,？有的凝固也就是一半凝,。

  我的步驟：如營(yíng)養(yǎng)瓊脂，按配比稱3.3g加100mL水,，加熱攪拌溶解,，分裝到試管中后加棉花塞，包扎后于121℃滅菌鍋中滅菌20分鐘,，好了之后制作斜面,，等了有半小時(shí)久，培養(yǎng)基都不凝固這是為何,？

  答：你先要煮沸溶解培養(yǎng)基，攪拌均勻，稍冷后（50℃）盡快分裝,，瓊脂的在水中需加熱至95℃時(shí)才開(kāi)始熔化,，你只是加熱攪拌溶解，瓊脂是不是真正溶解透了有待考證,。

  試管滅菌完畢,，拿出來(lái)晃一晃再擺斜面，否則容易上層稀不凝固,，下層濃很容易凝固,。跟三角瓶滅培養(yǎng)基是一樣的道理。

  問(wèn)：我煮了還是沒(méi)很凝固這是為什么,？

  答：先加熱煮沸,，直至白色泡沫上升，然后再分裝,、高溫高壓滅菌,。

  問(wèn)：白色泡沫上升好危險(xiǎn)，我試過(guò)被瓊脂沸騰連塞子噴我一臉,！

  答：我們通常都是用搪瓷缸,，最多裝液量1/3，煮沸三次,，徹di煮透,、溶透。

  問(wèn)：溶解后用吸量管分裝,，在吸量管中就凝固了,，要怎么分裝？量筒嗎,？

  答：我們都是用10 mL或5 mL移液槍分裝的,，再把分裝試管塞好滅菌。

  煮沸溶解分裝然后滅菌制斜面成功了,！再次提醒,，滅菌后，溫度沒(méi)降下來(lái)前一定要搖一搖,，不管瓶裝還是試管裝,，都要搖勻！,！

案例四

  問(wèn)：瓊脂培養(yǎng)基制作斜面為什么無(wú)法wanquan凝固,，而做培養(yǎng)皿時(shí)wanquan凝固？

  答：瓊脂混合不均勻,。相比三角瓶,，試管的空間更加狹小,，開(kāi)鍋后一定要趁熱晃一晃，使底部沉積的瓊脂wanquan混勻,。否則就容易導(dǎo)致試管底部凝固,，而上部不凝固或凝固不好的問(wèn)題。

案例五

  問(wèn)：微生物檢驗(yàn)用的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,，可以第二次高壓滅菌么?有何影響,，如果加熱培養(yǎng)基使其溶化后，不一會(huì)兒就會(huì)凝,，而如果用高壓滅菌就不會(huì)很快凝固,，所以想再用高壓濕熱滅菌，加熱使其溶化,，可否?

  答：二次高壓濕熱滅菌,，會(huì)導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)成分的損失。所以,，最好是通過(guò)水浴加熱,，溫度維持在100度，瓊脂就可wanquan化開(kāi),，冷卻至50度左右,，就可進(jìn)行倒板等操作了。

  問(wèn)：培養(yǎng)基能加熱幾次?營(yíng)養(yǎng)瓊脂和玫瑰紅鈉配置好了以后,，我是保藏在冰箱里的,，同一瓶最多能水浴幾次使用呢?

  答：在保證不染菌的情況下是可以多次使用的。瓊脂的溶解溫度是95度,，若水浴的話時(shí)間來(lái)得及可以是沸水浴,。若是時(shí)間緊迫可直接放在電爐上熔化，但要一直盯著,，防止沸出來(lái),。如果是已經(jīng)滅好菌的玻璃器皿，可以用微波爐加熱,，不過(guò)要注意觀察,，防止沸騰出來(lái)。一般從冰箱里拿出來(lái)就用一次,，不提倡反復(fù)融化,。

  問(wèn)：有人說(shuō)加熱時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，也會(huì)導(dǎo)致瓊脂不凝固,，是這樣嗎,？

  答：是的。通常來(lái)說(shuō),，滅完菌就要及時(shí)開(kāi)鍋取出培養(yǎng)基,。如果因?yàn)槠渌?，耽誤了，稍有延長(zhǎng)也不大要緊,，這里所說(shuō)的加熱時(shí)間過(guò)長(zhǎng),，是指高壓超過(guò)半小時(shí)或者滅菌后一直放在滅菌鍋內(nèi)很長(zhǎng)時(shí)間甚至過(guò)夜的情況,。這些都是錯(cuò)誤的操作,，即使培養(yǎng)基能凝固，里面的營(yíng)養(yǎng)成分也發(fā)生了很大的變化,，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判斷造成很大影響,。應(yīng)該杜絕類似的操作。

  通過(guò)上述幾個(gè)案例的分析,，我們可以總結(jié)一下,。遇到固體培養(yǎng)基不凝固的情況，通常首先考慮一下幾點(diǎn)：

  （1）瓊脂少,，特別是自己配制培養(yǎng)基時(shí),，可能根本就漏加瓊脂了；

  （2）pH值不對(duì),，實(shí)驗(yàn)室用水PH過(guò)低,，且配制完沒(méi)能調(diào)整pH，或者本身就是酸度很大的培養(yǎng)基,；

  （3）反復(fù)加熱,；

  （4）加熱時(shí)間過(guò)長(zhǎng)；

  （5）滅菌前是否煮沸溶透,，滅菌后是否搖勻,。

  結(jié)合自己的實(shí)際操作，一項(xiàng)一項(xiàng)排除查找原因,。這里面,，zui簡(jiǎn)單也最容易被忽視的就是滅菌后搖勻的問(wèn)題。

  本實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)對(duì)比發(fā)現(xiàn),，傾倒平皿前搖勻與不搖勻,，所形成的平板強(qiáng)度差異很大，如果不經(jīng)搖勻直接傾倒,，形成的平板有約有2/3凝膠強(qiáng)度過(guò)低,，不能滿足試驗(yàn)要求，而最后倒出的幾塊平板強(qiáng)度會(huì)急劇升高,，硬度過(guò)大,，也影響使用；而搖勻后再傾注的平板,，凝膠強(qiáng)度數(shù)值分布比較均勻,，滿足試驗(yàn)要求（表1,，圖2）。經(jīng)常聽(tīng)到有人說(shuō),，平常一直那么做（不煮沸,，不搖勻），都沒(méi)問(wèn)題,，實(shí)際上那樣倒出來(lái)的平板只是都凝固了而已,，即使能用，平板間凝膠強(qiáng)度的差異也是很大的,。

  希望大家在實(shí)際操作中一定注意,，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)的要求進(jìn)行操作。

附圖表：

表1 用相同方法配制的等量培養(yǎng)基開(kāi)鍋后搖勻與不搖勻傾倒成的平板強(qiáng)度

圖2 傾倒平板前培養(yǎng)基搖勻和不搖勻所傾注的平板強(qiáng)度規(guī)律

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